如何通过临床症状诊断蜜蜂真菌病？

如何进行蜜蜂病毒病的实验室诊断？

(1)传染性试验对于蜜蜂病毒性病原的鉴定，一般是在观察 症状和疾病发生特点的基础上，进一步确定病害的性质和种类，病害性质主要应依靠传染性试验的结果做出判定。此外，对一些病 毒也可以用检查细胞包涵体的方法来确定病原的种类。 而蜜蜂病 毒性病原主要是依靠蜜蜂个体之间的接触传播，或其取食污染饲 料通过消化道侵入，或依靠侵入蜂群内的敌害(虫、螨等)传播。由 于蜜蜂是很典型的社会性昆虫，它们都生活在小小的蜂巢中，个体 之间的接触和饲喂随时在进行，所以难于区别开来，或者说对目前 蜜蜂病毒性病原的传染性试验工作开展得不多，以至病害的性质 较难确定。 蜜蜂病毒的种类，也可以通过电子显微镜直接观察病...全部

   (1)传染性试验对于蜜蜂病毒性病原的鉴定，一般是在观察 症状和疾病发生特点的基础上，进一步确定病害的性质和种类，病害性质主要应依靠传染性试验的结果做出判定。此外，对一些病 毒也可以用检查细胞包涵体的方法来确定病原的种类。
  而蜜蜂病 毒性病原主要是依靠蜜蜂个体之间的接触传播，或其取食污染饲 料通过消化道侵入，或依靠侵入蜂群内的敌害(虫、螨等)传播。由 于蜜蜂是很典型的社会性昆虫，它们都生活在小小的蜂巢中，个体 之间的接触和饲喂随时在进行，所以难于区别开来，或者说对目前 蜜蜂病毒性病原的传染性试验工作开展得不多，以至病害的性质 较难确定。
   蜜蜂病毒的种类，也可以通过电子显微镜直接观察病毒的形 态等加以识别。但许多基层单位因条件所限无法使用，主要依靠 病害症状发生特点和传染性试验加以辨别。另外，还可以通过鉴 定病毒的生物学特性，如传播方法、寄主范围、寄主反应、体外保毒 期、稀释终点以及对温度的反应等来确定。
   (2) 血清学诊断蜜蜂病毒的种类，也可以应用血清学方法诊 断。血清学反应又叫做抗原-抗体反应，微生物及某些代谢产物都 是很好的抗原，可刺激机体产生相应的抗体，这种抗体可与抗原特 异性地结合并中和其致病作用。
   抗原与抗体的结合可在体内进行，也可在体外进行。在体外 进行时，因操作方法的不同，常可表现出各种不同的反应现象，如 凝集、沉淀、溶血、溶菌以及补体结合等。由于抗原与抗体结合具 有严格的特异性，故在临床上常用血清学反应来协助某些细菌性、 病毒性传染病的诊断。
   蜜蜂病毒同样具有抗原特性，将其注射到试验动物的血液中， 就能在动物血清中产生大量相应的特异性抗体。这种在血清中存 在的抗体在体外又能与相同的病毒起沉淀反应。在应用上通常是 把含有病毒的病蜂体液经过提纯后，制备免疫血清，并设法除尽血 清中能与正常的蜜蜂体液起沉淀作用的其他抗体。
  将含有病原抗 体的免疫血清保持在冷冻状态下备用。试验时，将不同浓度的抗原加到血清中，观察所发生的沉淀反应及其最大的稀释程度。根 据血清反应可以鉴定病毒的种类和体系，如有条件，还可以测定病 毒浓度的相对量，并在病毒潜育期发现潜伏的病毒，做出早期诊 断。
  同样，血清学诊断也可以应甩于细菌病害的诊断。在蜜蜂病 害中已成功地应用血清反应来诊断美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐 臭病和慢性麻痹病。血清学诊断的具体操作方法如下。 ① 抗原的制备取典型病蜂50只，置于研钵内研碎，加磷酸 缓冲液或生理盐水50毫升(pH 7。
   2〜7。 4)，制成悬浮液，在6 000 转/分离心15分钟，取上清液，再经石棉漏斗过滤后制成。经无菌 检查合格后，置于低温冰箱中保存备用。 ② 抗体的制备先用已制备好的抗原按下列剂量和程度注入 兔耳静脉内，注射完毕后，2周后采血，分离血清，保存在一20°C条 件下备用。
   ③ 诊断将供检病蜂的组织，浸入卡尔努氏液（无水乙醇6 份，三氯氮甲烷3份和冰乙酸1份配成）30分钟，再以常规方法将 中肠取下用石蜡包埋，制成切片。切片经脱蜡后，用稀释1/10的 已制备的抗体血清涂上。
  放在37°C条件下20分钟，再用蒸馏水 仔细冲洗后，用异硫氰酸盐荧光色素进行标记。 经标记后的切片标本，即可放在荧光显微镜下，以水浸没进行 镜检。仔细观察蓝-紫色荧光，并做显微摄影。 经研究结果发现，用病蜂制备的组织切片，在中肠细胞内形成 具有特殊发光的、近圆形的、多形态的内含物，并局限在细胞质的 围核部分，直径为0。
  5〜2微米。 (3) 反转录聚合 _ 链式反应（reverse transcription-PCR，RT- PCR)技术由于大多数蜜蜂病毒病的症状不够典型，且在一般情 况下蜜蜂病毒处于潜伏状态，只有蜂群健康受到胁迫时(如受冻、 蛾害等)才易于爆发，所以蜂群内病毒的感染情况一般不易发现。
   同时，病毒的分离和形态观察对设备要求很髙，而血清学鉴定又极为烦琐耗时。新发展的反转录聚合酶链式反应鉴定技术克服了上 述缺点，开辟了病毒检测和鉴定的新领域。反转录聚合酶链式反 应的基本原理完全建立于聚合酶链式技术之上，根据目标病毒的 已知核酸序列资料设计特异性引物，以待检病毒的核酸序列为模 板，通过聚合酶链式反应技术，能扩增出目标病毒的特异性片断即 为阳性，反之为阴性。
  由于绝大多数病毒核酸为RNA，所以在扩 增检测前要将RNA反转录为相应的cDNA，以此cDNA作为聚 合酶链式反应技术的模板。到目前为止，已经在蜜蜂上至少分离 鉴定出18种病毒，其中有8种病毒的全基因组测序工作已经完 成，1种慢性蜜蜂麻痹病病毒的测序基本完成。
  另外，还有大量的 蜜蜂病毒编码依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase)的基因序列，这些序列资料为利用反转录聚合 酶链式反应技术检测和鉴定蜜蜂病毒提供了广阔的空间。
  目前该 技术已成功用于从蜜蜂躯体、粪便、饲料（包括蜂蜜、花粉和王浆） 等样品中直接检测蜜蜂病毒，并经过改进可在一个反转录聚合酶 链式反应技术中同时检测多种蜜蜂病毒。反转录聚合酶链式反应 技术检测蜜蜂病毒具有便捷、快速和特异性强的特点，尤其对于检 测潜伏状态的病毒感染具有很高的灵敏性，该技术可能成为研究 蜜蜂病毒病流行病学的有力工具。
  收起