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    云南普洱茶渥堆过程中的微生物 来源：普洱茶文化网 文章作者： 周红杰 杨行吉 杨伟 韩俊 李家华　时间：2005年11月28日14:46 摘要：对云南普洱茶渥堆过程微生物的研究表明：在普洱茶加工过程中，主要微生物是黑曲霉（Aspergillium niger）、青霉属（Penicllium）、根霉属（Rhizopus）、灰绿曲霉（Aspergillium gloucus）、酵母属（Saccharomyces）、土生曲霉（Aspergillium terreus）、白曲霉（Aspergillium candidus）、细菌类（Bacterium）等，其中黑曲霉产生的最多，酵母次之。
    这些微生物在普洱茶的品质形成中都直接或间接地参与了作用。Yunnan Puerh Tea of Microorganism in the File-ferment*Zhouhongjie Yangxingji Yangwei Lijiahua Hanjins Wuxinzhuang Zhaolongfei Taoyong Liguosheng Jiangzifang Ganyueming(1。
     Department of Tea Science,Yunnan Agriculture University, 650201, Kunming China; 2。
   Shunde Tea factory of Kunming west mountain,650118,Kunming China 3。  Tea Breeding Institute of Baoshan)Abstract:Studied Yunnan puerh tea of microorganism in file-ferment showed: The main microorganism in the File-ferment that is Aspergillium niger, Penicllium, Rhizopus, Aspergillium gloucus, Saccharomyces, Aspergillium terreus, Aspergillium candidus, Bacteriumetc, Among them Aspergillium niger produce at most, then Saccharomyces。
     These microorganisms is all direct or indirectly with puerh tea quality formation function in file-ferment。
  Key words: Yunnan puerh tea; file-ferment; Microorganism; Quality关键词：云南普洱茶； 渥堆；微生物；品质普洱茶是产于云南的西双版纳、思茅、临沧、下关等地，以云南大叶种制成的晒青毛茶作为原料，经过自然氧化或发酵加工精制而成的茶叶。
    历史上所指的普洱茶是云南大叶种加工的一系列云南茶叶的总称。可以追溯到东汉时期，距今已有两千多年的历史。普洱茶是云南的历史名茶。目前，普洱茶畅销港、澳、台和东南亚，以及法国、日本等地。
  普洱茶在加工上是后发酵茶，分散茶和蒸压成型两类。普洱茶的品质特征外形条索肥硕壮实，色泽褐红（俗称“猪肝色”）或带灰白色。  依形状不同可分为碗型普洱茶，长方形普洱茶和圆形的七子饼等[1]。
  普洱茶的内质特点是汤色红浓明亮，滋味醇和回甘，具有独特陈香。国内外临床验证表明普洱茶对人体确有保健功能。如法国巴黎安东尼医学系临床教学主任艾米尔•卡罗比[2]医生用云南普洱沱茶作临床证明：“云南普洱茶对减少类脂化合物，胆固醇含量有良好的作用”。
    日本学者I。Tomita等，王旭华等，法国国立健康和医学研究所，巴黎亨利伦多教授[3]等均对云南普洱茶临床试验表明，普洱茶可降血脂。中国昆明医学院[4]也对云南普洱沱茶治疗高血脂病的疗效用了55例临床试验，并与降脂较好的药物安妥明治疗的31例作比较，普洱茶的疗效高于安妥明。
    在国外，云南普洱被冠予“减肥茶”、“窈窕茶”、“美容茶”、“益寿茶”的美称。是公认的最佳保健饮品。根据陈宗道[5]研究发现普洱茶渥堆过程中存在有黑曲霉、青霉、根霉、灰绿曲霉、酵母等微生物，黑曲霉约占微生物总数的80%左右。
  胡建程[6。7]等先后在各种再加工茶中分离鉴定出青霉（Penicllium）、曲霉（Aspergillium）、毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）、蜡中枝孢霉（Cladosprium）、交链孢霉（Alternaria）、弯孢霉（Currularia）、链刀霉（Fusarum）、匍柄霉（Stemphypium）等。
    并且经研究发现在渥堆前期中温型霉生长繁殖迅速，后期低温嗜干的灰绿曲霉开始繁殖。并有酶系活动，使内含成分发生了深刻的变化。罗龙新[8]等研究了云南普洱茶渥堆过程中主要的生化成分及水浸出物等含量的变化，其结果表明，茶叶中的主要生化成分均随渥堆时间延长而剧烈变化。
  至渥堆结束时，茶多酚、儿茶素、TF、TR、氨基酸和可溶性糖含量均剧烈的下降；TB和水不溶性茶多酚则明显增加，但水浸出物含量并未明显下降，说明茶叶中内含物质通过氧化、降解、缩合等反应已产生新的色香味成分。
    这些成分的剧烈变化，除了在特殊条件下的湿热作用外，微生物的参与起到了最为关键的、不可替代的作用。经查新表明，国内外对普洱茶的研究仅从临床应用的结果分析了普洱茶的保健功效及研究了普洱茶在渥堆过程中内含成分的变化。
  对普洱茶系统的原料选择、科学的加工方法，特别是对云南普洱茶形成的关键工序—渥堆发酵过程中的微生物变化、主要可食用微生物分泌的酶系的变化尚未科学系统的研究，从微生物和酶的角度研究云南普洱茶的渥堆发酵与品质的形成尚属空白。
    本文仅针对云南普洱茶渥堆发酵过程中微生物的变化与其品质关系的研究，旨在科学揭示云南普洱茶提供一定的理论依据。*本文内容属于：校发展基金“普洱茶新产品开发研究”和省教育厅“普洱茶品质形成机理与保健成分变化的研究”资助项目2。
   研究材料和方法2。1 研究材料2。  1。1 试验材料的选择 昆明市西山区德顺茶厂的临沧镇康毛茶、潮水发酵生产的茶样（第一次翻堆茶、第二次翻堆茶、第三次翻堆茶、第四次翻堆茶、出堆茶）。
  试验室内模拟大生产发酵生产的第一次翻堆茶、第二次翻堆茶、第三次翻堆茶、第四次翻堆茶、出堆茶。经灭菌处理发酵生产的第一次翻堆茶、第二次翻堆茶、第三次翻堆茶、第四次翻堆茶以及接种黑曲霉发酵模拟大生产的第一次翻堆茶、第二次翻堆茶、第三次翻堆茶、第四次翻堆茶、出堆茶的茶样作为试材。
    2。1。2 培养基的选择分离曲霉类的培养基（PDA培养基）、黑曲霉纯化培养基、分离酵母的培养基（麦氏培养基）、分离细菌的培养基2。2 主要仪器设备MISK 15型电冰箱、WS/08-01型调温调湿箱、766型红外线辐射干燥箱LX-600型超级微型高速离心机、OLY-MPUS摄影显微镜、UV-240PC联机紫外分光光度计、超净工作台、PHS-2型酸度计、METTLER AE163数显电子天平2。
    3 实验方法2。3。1 曲霉类、酵母、细菌的分离、鉴定和计数 样品稀释液的制备[9] 培养基的配制及灭菌[10] 接种[11] 选菌及纯化[12] 载片培养 显微观察及显微摄影2。
  3。2 微生物的计数[13]2。3。3 感官审评3 结果与分析3。  1 普洱茶渥堆茶样中的主要微生物3。1。1 黑曲霉（Aspergillium niger）是一种低等真核生物[14]，作为世界公认的安全可食用性，在工业生产和学术研究中占有重要的地位。
  近年来黑曲霉的转化技术、黑曲霉分泌糖化酶基因的分离与鉴定及外源基因在黑曲霉中的表达[15]等的科研成果，引起了广泛的重视。  对黑曲霉中的一些种作为研究高等真核生物基因表达调控机理取得了可喜的结果。
  作为参与普洱茶品质形成的重要菌种，研究其生命周期及其代谢产物变化有着重要意义。其菌体显微照相如下： 图1平板上的菌落 图2（40）产孢结构 图3（100）产孢结构黑曲霉（Aspergillium C下培养三天直径一般大约为47~63mm，少数菌株生长较局限，多数生长较快，菌落平坦或中心稍凸起，有规则或不规则的辐射状沟纹，质地丝绒状或稍呈絮状，有的菌偶有过度生长，分生孢子大量，表面呈暗褐色至炭黑色，渗出液有或无；有的菌株产生菌核，在平面培养基上生于中央，在斜面上多生于基部，菌落反面无色、黄色、黄褐色或带微黄绿色，分生初为球形至辐射形，直径150~470niger）属于半知菌亚门（Deuteromycotina）；丝孢纲（Hyphomycetes）；丛梗孢目（Moniliales）；丛梗孢科（Moniliaceae），曲霉属（Aspergillus）[14]。
    菌落在PDA培养基上生长迅速，在28~30 mm。老后分裂成几个圆柱形，可达780 mm左右。黑曲霉在生产中的重要经济意义在于，用于食品工业生产柠檬酸和其它有机酸，同时可资利用许多酶。
  如糖苷酶、果胶酶、葡萄糖淀粉酶、纤维素酶、柚苷酶、乳酸酶、葡萄糖氧化酶[16]等。  在普洱茶渥堆过程中黑曲霉代谢产生的有机酸和酶对普洱茶品质的形成无疑是有重要的作用的。从表1可以看出，黑曲霉在普洱茶渥堆过程中始终是以优势菌群作用着普洱茶。
  3。1。2 青霉属（Penicillium），青霉大多数种在生活史中只具有无性阶段，属于半知菌亚门（Deuteromycotina）；丝孢纲（Hyphomycetes）；丛梗孢目（Moniliales）；丛梗孢科（Moniliaceae），仅少数种部分有性阶段[17]。
    普洱茶渥堆试验中主要有常现青霉和普通青霉出现。常现青霉（Penicillium frequentans）菌落青绿色，地毯状，有时色淡，分生孢子球形和亚球形，分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，单个细胞球形或卵圆形。
  暗蓝色，背面呈橙褐色或墨绿色，小梗7~933。5mm,分生孢子直径大约2。  3~3。1um，光滑，该种青霉能产生柠檬酸霉素[17、18]。产黄青霉(Penicillium chrysogenum)菌落蔓延，周围分泌黄色液，蓝绿色至亮绿色背面黄色，后变为褐色，分生孢子梗直径2。
  8~3。6um菌株形状为帚状枝，分生孢子以椭圆形为主。该种霉菌是能产生青霉素的一种霉菌[19]，在乳制品、面包、肉制品、果实、蔬菜等有机物中最常见，广泛用于医药。  菌体显微照相如下： 图1普通青霉的菌落营养体 图2是产黄青霉的菌落营养体 图3（60）普通青霉放大60倍菌株 图4（60）产黄青霉放大60倍菌株在普洱茶渥堆过程中青霉产生的柠檬酸霉素、产黄青霉代谢产生的青霉素对杂菌、腐败菌可能有良好的消除和抑制生长作用，因此，对普洱茶醇和品质的形成可能有辅助作用。
    3。1。3 根霉属（Rhizopus）是属于接合菌亚门（Zygomycotina）、接合菌纲（Zygomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）[20]。
  除了细菌以外，根霉是迄今为止丝状菌中产L乳酸的另一重要菌种[21]。菌体显微照相如下： 图1根霉属菌落营养体 图2放大60倍的菌丝体 图3放大60倍的孢子 菌落营养体在培养基上呈白色，绒毛状，葡萄菌丝弓状弯曲在与培养基表面相接处产生假根，假根发达，分枝多，两节间距离大约为1~2um，孢囊梗直立不分枝，孢子囊球形或椭圆形褐色或黑色，囊轴球形、椭圆形，直径约为55um，高约70um。
    但由于分泌果胶酶能力强，常会引起食品腐烂，普洱茶在渥堆中茶叶软化也与此霉滋生有关。在渥堆中的每个阶段，控制好中温中湿的环境，提高根霉菌的比例，有利于普洱茶粘滑和醇厚品质的形成。
  3。1。4 灰绿曲霉（Aspergillium gloucus）属于半知菌亚门（Deuteromycotina）；丝孢纲（Hyphomycetes）；丛梗孢目（Moniliales）；丛梗孢科（Moniliaceae），曲霉属（Aspergillus）[22]。
    菌体显微照相如下： 图1 图2 图3图1是灰绿曲霉（Aspergillium C下培养三天的菌落营养体结构；图2是灰绿曲霉（Aspergilliumgloucus）在PDA培养基上在28~30 C培养8天的菌落营养体结构；图3是在显微镜下放大40倍的菌株及孢子头结构。
    gloucus）在PDA培养基上在28~30C培养3~4天可长到1。20~1。70cm左右大小，菌丝质地呈地毯状，菌落背面呈乳黄色、黄褐或橙褐色，该菌种会使食品腐烂变质。
  生产中应尽量避免菌群的滋生。从表1可以看出，在大生产中出现得较多，而模拟、灭菌渥堆试验加工的普洱茶中出现很少，后期消失。  因此，控制堆温、改善制茶环境卫生有利于纯正普洱茶品质的形成。
  菌落灰绿色或黄绿色，营养菌丝有些会含有红色至橙色的颗粒，子囊壳黄色至橙色，小梗单层，分生孢子椭圆形至亚球形，在28~303。1。5 酵母属（Saccharomyces）是普洱茶品质形成的重要菌种，属于真菌门（Fungi）；子囊菌纲(Asconycetes)；半子囊菌亚纲（Hemiasconycetes）；酵母目（Endonycetales）；酵母亚科（Saccharomyces Toideae）。
    菌体显微照相如下： 图1 图2 图3 图4C培养3~4天长成的营养体菌落图；图2是酵母菌（Saccharomyces）连着平板培养基在显微镜下放大20倍的营养体结构；图3是酵母菌（Saccharomyces）在显微下放大60倍的细胞结构；图4是酵母菌（Saccharomyces）在酵母浸膏培养3~4天菌落中的细胞和出芽细胞。
    图1是酵母菌（Saccharomyces）在28~30酵母菌（Saccharomyces）营养细胞为圆形、卵形或长圆形；呈乳白色和粉红色；光亮、稠粘、易挑取；在培养基表面，不深入到培养基内部；扁平光滑；在麦氏培养基中培养3~4天营养体长成为3。
  4~6。  82。3~5。2um；子囊孢子圆形、卵形和肾形等。酵母菌能利用多种糖类代谢产生维生素B1、B2、维生素C[23]、SOD[24]，并且酵母本身除有高含量高吸收率的微量元素外，还可提供相当数量的蛋白、必需氨基酸及丰富的维生素、酶、甘露寡糖及一些重要的辅助因子[25]等，是与人类密切相关的一类菌群。
    在普洱茶渥堆过程中控制数量得当，可以增加普洱茶中的有效营养物质以及对人体有保健作用的物质。且有利于形成普洱茶甜醇、甜香的品质风格。但是，如果控制不当，则会形成辣、刺、叮、麻、挂、锁、酸等不利的物质，影响和降低普洱茶的品质。
  在普洱茶渥堆过程中除上述几种微生物外，还有土曲霉（Aspergillium terreus）、白曲霉（Aspergillium candidus）、少量的细菌（Bacterium）和极少量几种未检出的微生物。
    结合表1不同处理普洱茶渥堆过程中的主要微生物变化和表2不同处理普洱茶渥堆过程中品质的变化分析说明：普洱茶制作过程中微生物的菌种变化是极其复杂的，在普洱茶渥堆过程中，这些微生物都对普洱茶的品质形成产生着作用，有的微生物自始至终对普洱茶品质形成发挥着积极的作用，有的微生物是在普洱茶加工的某一阶段发挥着形成普洱茶独特风格的作用，有的微生物则不利于普洱茶品质的形成。
    因此，从普洱茶加工过程中的原料入手，研究普洱茶品质形成的水热条件，研究分析普洱茶渥堆过程中微生物的特征特性是揭示普洱茶品质形成机理的核心内容。3。2 不同处理普洱茶渥堆过程中的主要微生物变化表1 普洱茶不同加工处理渥堆各工序微生物数量变化表（单位105个/克干重）从表1可知，霉菌之间的关系表现为：在普洱茶大生产中黑曲霉(Aspergillium niger)>酵母（Saccharomyces）>根霉（Rhizopus）>青霉（Penicllium）>细菌（Bacterium）>灰绿曲霉（Aspergillium gloucus）>土曲霉（Aspergillium Terreus）>白曲霉（Aspergillium candidus）；而在普洱茶模拟试验中黑曲霉(Aspergillium niger)> 酵母（Saccharomyces）>青霉（Penicllium）>根霉（Rhizopus）>灰绿曲霉（Aspergillium gloucus）>细菌（Bacterium）>土曲霉（Aspergillium Terreus）>白曲霉（Aspergillium candidus）；并且在灭菌试验中黑曲霉(Aspergillium niger)> 酵母（Saccharomyces）>根霉（Rhizopus）>青霉（Penicllium）>白曲霉（Aspergillium candidus）>土曲霉（Aspergillium Terreus）>细菌（Bacterium）。
    从以上三个不同处理比较分析可知，无论是大生产试验、还是模拟试验、灭菌试验，黑曲霉数量始终处于优势地位。酵母菌的总数居次，这表明良好普洱茶具有的甘滑、醇厚、活顺、陈香等品质特点与黑曲霉、和酵母在普洱茶渥堆中主从优势有密切的关系。
  因此，它们的变化对普洱茶品质产生的作用，值得进一步深入的研究。  3。3 不同处理普洱茶渥堆过程中品质的变化表2 不同处理普洱茶渥堆过程中汤色、香气、滋味和叶底的变化情况从表2看出，在普洱茶加工过程中，无论是大生产、还是模拟试验和灭菌试验，其渥堆过程中茶叶品质随着发酵深度，汤色、香气、滋味、叶底都发生了深刻的变化。
  汤色由黄绿色变为红浓明亮，香气由纯正的清香变为浓厚的醇香或带樟香气，滋味由苦涩变为醇和，叶底由硬绿转为棕褐柔软。  在模拟试验渥堆过程中始终没有嗅到何种异样的气味产生，而灭菌渥堆试验的普洱茶不仅汤色略深于大生产和模拟试验，而且到渥堆的后期出现了樟香的气味，并且在滋味中也尝到了樟香味道。
  从而可推知，灭菌试验生产普洱茶在改善品质方面有特殊意义。结论4。1 普洱茶品质形成的重要因子是微生物黑曲霉（Aspergillium niger）、青霉（Penicllium）、根霉（Rhizopus）、灰绿曲霉（Aspergillium gloueus）、酵母（Saccharomyces）、土曲霉（Aspergillium terreus）、白曲霉（Aspergillium candidus）和细菌（Bacterium）等在普洱茶的加工中，直接和间接的参与了普洱茶品质形成的作用，其中黑曲霉最多，约占微生物总数的70%左右，其次是酵母菌，它们是普洱茶渥堆过程中制约和影响普洱茶品质的重要菌种。
    4。2 微生物生命活动和代谢产物是普洱茶品质形成的重要因子，其中葡萄糖淀粉酶、纤维素酶和果胶酶，可以分解包括有多糖、脂肪、蛋白质、天然纤维、果胶和不可溶性水化合物等有机物。
  水解产物大多为单糖、氨基酸、水化果胶和可溶性碳水化合物。是形成普洱茶甘滑、醇厚的物质基础。  19在普洱茶渥堆过程中，微生物生命代谢中可产生大量的酶，并作用于普洱茶。
  如黑曲霉可以产生内、外两类酶。黑曲霉大约能产生20种左右的水解酶主要参考文献： 1 周红杰。 普洱茶的品质特点及健身作用。 农牧产品开发。   1997（2）：17~18 法国。
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