禽流感的实验室诊断方法有哪些？
由于该病的症状变化较大且无典型性，所以确诊需要实验室方 法进行，诊断方法主要包括病原学、血清学和分子生物学3部分。(1)病原学的诊断方法病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，是检测病原的“黄金标准”。 新建立的诊断方法成立与否均需 要用该方法进行验证，但操作程序繁琐，费用高且耗时费力。另外，病毒在感染过程中的不同阶段、在不同的组织部位中的分布和含量 存在差异，因此不能保证每次采样均能分离到病毒，从而易造成 漏检。 ①分离病毒以采集气管和泄殖腔拭子为最佳，采集死后的组织 样品以气管、肺、脾及大肠为最佳。常采用9 ~ 11日龄无特定病原 鸡胚或犬肾上皮连续细胞系进行禽流感病毒分离培养。若病...全部
由于该病的症状变化较大且无典型性，所以确诊需要实验室方 法进行，诊断方法主要包括病原学、血清学和分子生物学3部分。(1)病原学的诊断方法病毒的分离鉴定是禽流感的经典诊断方法，是检测病原的“黄金标准”。
新建立的诊断方法成立与否均需 要用该方法进行验证，但操作程序繁琐，费用高且耗时费力。另外，病毒在感染过程中的不同阶段、在不同的组织部位中的分布和含量 存在差异，因此不能保证每次采样均能分离到病毒，从而易造成 漏检。
①分离病毒以采集气管和泄殖腔拭子为最佳，采集死后的组织 样品以气管、肺、脾及大肠为最佳。常采用9 ~ 11日龄无特定病原 鸡胚或犬肾上皮连续细胞系进行禽流感病毒分离培养。若病料中有 病毒，传代后的尿囊液具有红细胞凝集作用，若初次传代未检测到 血凝活性，可将收获的鸡胚尿囊液盲传三代，若仍不出现血凝性，则可判定为阴性。
有红细胞凝集作用的病毒要首先排除新城疫病毒 后，再作进一步的鉴定。病毒分离鉴定方法周期较长。②电镜检测技术。流感病毒为正黏病毒，属于形态特征性强的 病毒，因而可用电镜技术或免疫电镜技术来诊断。
临床采集的少量 疑似病例肺组织，可用2。 5%的戊二醛固定，制成超薄切片，透射电 镜观察（X15 000 ~X300 000)。电镜下可见流感病毒粒子呈球形或 丝状，球形病毒粒子直径在80 ~120nm,也可见獎膜及囊膜上的 纤突。
电镜技术快速、准确，但检验结果与样品制备技术、病料的采 集部位和时间有关，且本方法不能用于亚型及致病性的测定。免疫电镜技术可以用来分析病毒粒子的成分及含量，以及包装进病毒粒子的细胞成分。(2)血清学诊断方法主要是根据抗原和抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。
现已有覆盖HI~ H16和N1 ~ N10的标准诊断及分型抗原和血清，并 以此为基础，建立了多种禽流感抗原和抗体的检测方法。如琼脂扩 散试验、血凝和血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、病毒中和试 验、免疫荧光试验、胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附试验等。
已 广泛应用于流行病学调查和免疫学研究以及疫苗免疫原性的评价等 领域。这些诊断方法大多对试验条件要求较高，需要特定仪器，适 用于实验室诊断，操作起来需要耗费一定的时间。1)琼脂扩散试验。用于流感病毒亚型的检查。
所有的禽流感病 毒亚型都有型特异性的、共同的保守性抗原，可用一种禽流感病毒 抗原或血清对所有A型禽流感病毒的抗体或抗原进行鉴定。抗原由标准毒株或已知毒株制备，一般取绒毛尿獎膜经磨细、 冻融等步骤提出病毒，再用0。
1% ~0。2%的甲醛灭活后36 ~48h制 成。将已知抗原、待检抗原、待检血清、已知血清加人1%的琼脂板 孔中，室温扩散24h。若用已知抗体检测待检抗原，当已知抗原和阳 性血清之间出现沉淀线，待检抗原与阳性血清间出现沉淀线，并且 沉淀线与邻近的阳性抗原和抗血清沉淀线相连，就可判定为阳性反 应，即待检抗原为A型流感病毒。
若用已知抗原检测待检血清中的 抗体，出现沉淀线者为阳性。2)对流免疫电泳技术。原理与琼脂扩散试验完全相同。将抗体 加人琼脂板孔中，电泳lh，在阳性对照出现沉淀线，阴性对照不出 现沉淀线的情况下，出现沉淀线者为阳性。
3)血凝和血凝抑制试验。①血凝和血凝抑制试验可用以区别鸡新城疫病毒。病料经磨细、冻融等步骤处理后，加人到鸡红细胞液中进行红 细胞凝集试验。病料或分离毒株胚液加抗鸡新城疫血清加红细胞，进行红细胞 凝集试验。
若鸡新城疫血清不能抑制病料或分离毒株胚液能凝集红 细胞的特性，则可排除鸡新城疫感染。②血凝抑制试验可确定分离病毒的血凝素和神经氨酸酶亚型。“胚液”加“抗H1-H16血清”加“红细胞”，其中某一亚型血 清能抑制病毒凝集红细胞，其血凝素即为那一亚型。
“胚液”加“抗N1-N10血清”加“红细胞”，其中某一亚型血 清能抑制病毒凝集红细胞，其神经氨酸酶即为那一亚型。③分子生物学诊断技术。因其具有特异性高、敏感性强、快速、 对样品的要求不高等优点，已被大量应用于禽流感的快速诊断中， 常用的有RT-PCR技术、RT-PCR-酶联免疫吸附法、实时RT-PCR 检测技术、依赖核酸序列的扩增技术、异源双链体迁移率测定法、 核酸探针技术、基因芯片技术等；其中，依据其原理和技术特点的差异，RT-PCR技术又分为常规、巢式、荧光、多元PCR和PCR- RFLP、荧光定MRT-PCR等。
如设计禽流感病毒的HA基因和NA基 因的简并引物进行RT-PCR，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，并 与DNA分子标准DL2000比较，在0。 8kb处有4条特异性条带则为阳性。近年来禽流感病毒的检测手段已经得到非常大的改进和发展，已经开发出多种商品化的检测试剂盒。
相信随着对禽流感病毒分子 生物学知识更深人的认识，禽流感病毒的检测技术会不断涌现出更 快速、更具有敏感性和特异性的方法。收起
