pcr的实验步骤是什么样子的？
pcr实验步骤
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BIOGHC Elitefast SYBR Mix包含dNTP Mix、Mg2 、SYBR Green I；BIOGHC Elitefast Enzyme Mix包含BIOG超级逆转录酶、RNase 抑制因子和BIOG热启动聚合酶。
一般来说反应体系中引物终浓度为0。 2μM可得到较好的扩增效果。当反应结果不理想时，可以在0。1-1。0μM范围内调整引物浓度。qPCR反应灵敏性高，模板量的准确性对结果影响很大，建议将模板适度稀释后加入。
扩增产物长度请选择在100bp-500bp范围内。 反应条件：先于50℃逆转录反应30分钟，再于95℃加热10分钟，以激活热启动DNA聚合酶，然后95℃ 15秒，60℃ 35秒，进行40个循环。
该反应条件可根据目标片段的大小、引物的Tm值等适当调整。
一般来说反应体系中引物终浓度为0。 2μM可得到较好的扩增效果。当反应结果不理想时，可以在0。1-1。0μM范围内调整引物浓度。qPCR反应灵敏性高，模板量的准确性对结果影响很大，建议将模板适度稀释后加入。
扩增产物长度请选择在100bp-500bp范围内。 反应条件：先于50℃逆转录反应30分钟，再于95℃加热10分钟，以激活热启动DNA聚合酶，然后95℃ 15秒，60℃ 35秒，进行40个循环。
该反应条件可根据目标片段的大小、引物的Tm值等适当调整。
双诚联盈净化工程技术——PCR实验步骤大致分三个步骤：一、组织的抽提：1。 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末2。 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3。
移入1。5ml新离心管用5 ml针头抽打4。 冰上孵育5分钟5。 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1。5ml新离心管6。
加0。2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7。 离心8。 加0。5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9。 离心10。 加入1 ml 75%乙醇，震荡11。
离心12。 室温下使之变透明13。 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）14。 走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：大约20分钟RNA 抽提物 5μlRadome 引物 2μlRNA sin 0。
5μl1。 65℃ 15分钟2。 立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时RNA sin 0。5μl10mM dNTP 1μl5×RT 缓冲液 4μl25mM MgCl2 4μlAMV 逆转录酶 3μl1。
37℃ 1。5小时2。 94℃ 5-10分钟3。 反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4。5小时25mM MgCl2 2μl10×PCR 缓冲液 5μl10mM dNTP 1μl上下游引物10pmol/μl 2。
5μl×2CDNA模板 2。5μlddH2O 34μlTaq酶 0。5μl轻质石蜡油 50μl100μl1。 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环2。
94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环3。 72℃ 10分钟4。 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时25mM MgCl2 3μl10×PCR 缓冲液 5μl10mM dNTP 1μl上下游引物10pmol/μl 2。
5μl×2CDNA模板 5μlddH2O 30μlTaq酶 1μl轻质石蜡油 50μl 100μl1。 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环2。
94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环3。 72℃ 10分钟4。 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1。 25小时1。
配0。5×TBE电泳缓冲液300 ml2。 胶浓度1。7%（40ml 0。5×TBE加0。68g胶）3。 微波炉中火2分钟溶解胶4。 冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0。
5μg/ml）5。 放入梳子，浇板，待凝固6。 加8μl PCR反应产物 2μl溴酚兰7。 电泳50-80V（每㎝ 5V）。
移入1。5ml新离心管用5 ml针头抽打4。 冰上孵育5分钟5。 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1。5ml新离心管6。
加0。2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7。 离心8。 加0。5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9。 离心10。 加入1 ml 75%乙醇，震荡11。
离心12。 室温下使之变透明13。 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）14。 走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值，计算RNA浓度二、RT反应体系（第一步）：大约20分钟RNA 抽提物 5μlRadome 引物 2μlRNA sin 0。
5μl1。 65℃ 15分钟2。 立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约2小时RNA sin 0。5μl10mM dNTP 1μl5×RT 缓冲液 4μl25mM MgCl2 4μlAMV 逆转录酶 3μl1。
37℃ 1。5小时2。 94℃ 5-10分钟3。 反应物保存于-20℃或进行PCR三1、PCR反应体系：约4。5小时25mM MgCl2 2μl10×PCR 缓冲液 5μl10mM dNTP 1μl上下游引物10pmol/μl 2。
5μl×2CDNA模板 2。5μlddH2O 34μlTaq酶 0。5μl轻质石蜡油 50μl100μl1。 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环2。
94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步30个循环3。 72℃ 10分钟4。 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳三2、PCR反应体系：约5小时25mM MgCl2 3μl10×PCR 缓冲液 5μl10mM dNTP 1μl上下游引物10pmol/μl 2。
5μl×2CDNA模板 5μlddH2O 30μlTaq酶 1μl轻质石蜡油 50μl 100μl1。 94℃ 2分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟 为第一个步1个循环2。
94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分钟 为第二步40个循环3。 72℃ 10分钟4。 取出后4℃ 5分钟后-20℃保存或走电泳四、电泳：约1。 25小时1。
配0。5×TBE电泳缓冲液300 ml2。 胶浓度1。7%（40ml 0。5×TBE加0。68g胶）3。 微波炉中火2分钟溶解胶4。 冷却至60℃加入溴乙锭2μl（10mg/ml的终浓度0。
5μg/ml）5。 放入梳子，浇板，待凝固6。 加8μl PCR反应产物 2μl溴酚兰7。 电泳50-80V（每㎝ 5V）。
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