DNA Taq 酶
你不是要自己弄吧？还是公司里买算了。没有抽过，只能想当然的说说可能的方案
1。抽总蛋白
2。电泳（双向电泳大概能跑的更开点）
3。找到合适的点
4。回收
5。抗体鉴定，或者测序
Taq- DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。 yT是 一种嗜热真菌，能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的。
(一)DNA聚合酶活性与热稳定性
该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。 其比活性为200000单位/mg。75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延...全部
你不是要自己弄吧？还是公司里买算了。没有抽过，只能想当然的说说可能的方案
1。抽总蛋白
2。电泳（双向电泳大概能跑的更开点）
3。找到合适的点
4。回收
5。抗体鉴定，或者测序
Taq- DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。
yT是 一种嗜热真菌，能在70～75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的。
(一)DNA聚合酶活性与热稳定性
该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。
其比活性为200000单位/mg。75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒。温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性。
在92。5℃、95℃ 、97。5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可 保持50%的活性，实验表明。PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。
Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条 件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性， 其作用于类似逆转录酶。此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性 更高。
(二)DNA聚合酶离子依赖性
aqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0。7～0。8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行 PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2。
0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度。
一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0。5～1。0mmol/L。适当浓度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶 的活性。
(三)忠实性
TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，而无3’→5’外切活 性，它不具有Klenow酶的3’→5’校对活性。因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错 配，该酶是没有校正功能的。
Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2。1×10-4。
(四)抑制剂
低浓度的尿素、甲酰胺、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSD)对Taq DNA聚合酶的 催化活性并无影响。
极低浓度的离子表面活性剂如脱氧胆胺酸钠(小于0。06%)，十二烷 基肌氨酸钠(小于0。02%)，十二烷基硫酸钠(SDS，小于0。01%)几乎可完全抑制该酶的 活性。而非离子表面活性剂在较高浓度(Tween20，NP-40。
和Tritox-100)如>5%时方能 抑制该酶的活性。
低浓度的NP-40(0。05%)和Tween20(0。05%)能增强TaqDNA聚合酶的活性。低浓度SDS对 该酶的抑制作用可加入一定浓度的NP-40和Tween20抵消。
TaqDNA聚合酶可在-20℃贮 存至少6个月。
。收起
