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植物种质资源是发展农业生产和开展育种工作的基础。拥有丰富的种质资源,才可能不断育成新品种。而且“一个国家或研究单位所拥有的种质资源的数量和质量,以及对其特性和遗传规律研究的深度和广度是决定育种效果的重要条件,也是衡量一个国家或单位育种工作发展水平的重要标志之一。 ”C。M。Rick(1984)研究和鉴定了Lycopersicon Pennelli和L。Chilense抗旱性:樱桃番茄的耐涝性及对根腐性的抗性等,随后从回交中分离的新变异体为番茄育种提供了潜在的特性,为培育抗逆性强的新品种奠定了良好的基础。 目前,育种工作者已经对种质资源的搜集、保存进行了大量工作。然而,对一个种来说...全部
植物种质资源是发展农业生产和开展育种工作的基础。拥有丰富的种质资源,才可能不断育成新品种。而且“一个国家或研究单位所拥有的种质资源的数量和质量,以及对其特性和遗传规律研究的深度和广度是决定育种效果的重要条件,也是衡量一个国家或单位育种工作发展水平的重要标志之一。
”C。M。Rick(1984)研究和鉴定了Lycopersicon Pennelli和L。Chilense抗旱性:樱桃番茄的耐涝性及对根腐性的抗性等,随后从回交中分离的新变异体为番茄育种提供了潜在的特性,为培育抗逆性强的新品种奠定了良好的基础。
目前,育种工作者已经对种质资源的搜集、保存进行了大量工作。然而,对一个种来说,种质资源必定是有限的,而且常有随机性,通过基因工程创造植物新种质就成为必要。
基因工程是在七十年代以后发展起来的,它是在分子水平对生物进行遗传操作的一项技术。
1972年,Beig等首次用限制性内切酶EcoRⅢ,实现病毒SV40DNA和噬菌体入DNA的重组,成为实现了DNA重组的第一人。1973年,Cohen等人通过DNA体外重组,实现了细菌间性状的转移,Cohen因此成为基因工程的创始人,这一年也标志基因工程的诞生。
随着基因工程的不断成熟,它逐步走向了实际生产,尤其是给农业带来了曙光。对于植物来说,主要是用基因工程创造新的植物种质资源。70年代末、80年代初,人们发现根癌土壤农杆菌(Agrobact-erium tumefaciens)在侵染植物细菌后能将其质粒上的一段DNA(T-DNA)插入到被侵染细胞的基因组,并能遗传给后代,使植物遗传转化技术得到了发展。
1983年,Zambryskj等,1984年,De block等分别报道用切去癌基因的A。t。和A。r。进行基因转移,获得形态正常的转基因植株。1984年,Horsch首先报导入外源基因在植物体的遗传,标志着植物基因工程应用于种植业上,1985年,Horsch又首创了叶盘法转化烟草,获得转基因烟草,这些标志着植物基因工程创造植物种质资源的诞生。
自1986年以来,植物转基因工作开展很快,到1990年,已经有30多种转基因植物,而且1993年据陈章良报道,已有100多种植物通过基因工程技术获得了转基因植株,包括粮食、油料、蔬菜、果树、经济作物及花卉等一批重要的作物。
据估计,在1997年美国大约种植树150万亩转基因作物(抗虫的玉米、棉花、马铃薯、抗除草剂的大豆、耐贮的番茄),这极大地拓宽了植物种质资源,为农作物的品种改良及育种工作开辟了新的途径。这样育种者就能根据自己的意愿,来改善作物的抗病、优质、高产、耐贮、抗逆等性状,开拓了搜集种质资源的范围,提高了育种的速度和效率。
进行植物基因工程,必须经过几个关键性环节:(1)基因的克隆与分离;(2)基因的修饰与表达载体的构建;(3)植物的遗传转化即转基因;(4)转基因细胞或植物的筛选。
1、基因的克隆与分离路线
到目前为止,已经克隆并鉴定的用于植物的目的基因已达百个,如普遍关注的抗病、抗虫、抗除草剂基因,与植物重要生命活动有密切关系的基因:RuBp大、小亚基基因。
PEP羧化酶基因,光敏色素基因,钙调蛋白基因,硝酸还原酶基因;与蛋白质等品质有关的基因(如水稻、小麦的谷蛋白基因,菜豆、小麦储存蛋白基因和玉米的醇溶蛋白基因)等,与成熟有关的PG基因。此外还有蔗糖合成酶基因。
α-淀粉酶基因和乙醇脱氢酶基因等。无论分离哪一种基因,大致走以下两条路线。
(1)cDNA文库或gDNA文库钓取的路线
这条路线首先建立cDNA文库或gDNA文库。CDNA文库中主要是开放读码框(ORF)的文库。
首先根据转基因表达的部位或特异性选取一定的植物组织,从中提取RNA制备polyA RNA(含多聚腺苷酸的核糖核酸),经外体翻译确证mRNA的活性后,经逆转录酶作用合成第一链cDNA,再以此模板进行复制得到双链DNA,最后加上限制内切酶的接头并克隆到载体上,如细菌质粒、噬菌体和Cosmid,酵母的人工染色体等等。
而gDNA文库是用内切酶将高分子量的染色体DNA部分消化,克隆到合适的载体上,建立基因组文库。
建立文库后,就可用探针来钓取基因。近年来,用这种标准基因组成cDNA文库分离和克隆基因的技术进展很快。
染色体步查技术、转座子示踪技术、图谱克隆法、基因组相减技术、基因挽救技术以及最近发展起来的表达序列标记(Expressed Sequence Tage,ESTs)和mRNA差别显示,都是为了找出较合适的探针,从而钓取目的基因。
取出的cDNA即ORF(开放读码框),还可对基因组文库进行钓取,以钓取含内含子的全基因,使目的基因本身具有启动子(promoter)或终止子(terminator)。而且还可用已从微生物克隆出来的同源性基因,从文库中钓取。
(2)直接获得目的基因的方法
最近几年又发展新技术如PCR技术,人工合成基因等,可直接分离或克隆出目的基因。
PCR技术(polymerase chain reaction)技术能把单个目的基因大量扩增,这个方法必须在已知基因序列或已知该基因所翻译的氨基酸序列。
进而推断出因序列的情况下使用。它的主要方法:首先根据已知基因的碱基序列设计好一对引物。在以提取的植物DNA或通过mRNA逆转录的第一条cDNA为模板,在dNTP存在的情况下,通过DNA模板的变性、模板与引物的退火及引物的延伸三个阶段的多次循环,目的基因即被扩增,扩增片段经纯化后克隆到合适的载体上,用酶切分析和序列测定鉴定所得到的重组子。
这个方法简单、迅速,还可应用于病毒、基因等检测上,在国内外发展很快。
2、基因的修饰
目的基因被分离出以后,往往不具有完整的基因结构,而只是表达产物的开放读码(ORF)。还需加上启动子和终止子,启动子主要功能是决定转录起始的精确位置和转录的频率,终止子保证这个基因的正确表达。
在植物基因工程中,目的基因加上启动子和终止子来完成基因的修饰。
启动子可分为组成型表达调控的启动子、组织特异性基因调控的启动子。组成型表达调控的启动子调节控制下的结构基因的表达大体恒定在一个水平。
常用的是花椰菜病毒的35S启动子,功能强,应用非常广泛,另一个CAMV-19S启动子功能比35S启动子弱50倍左右,很少被采用。其次还有来自胭脂碱和章鱼碱合成酸的NOS启动子、OCS启动子和肌动蛋白(actin)启动子,如从水稻分离的actinI基因启动子也是一个强启动子,它可以指导GUS基因(B-葡萄糖苷酸酶基因),在植物细胞中表达。
组织特异性启动子只在特定的器官内以及特定的时间内表达。目前,所分离的大部分植物基因的启动子都有其表达的特异性,包括组织特异性、发育特异性及诱导特异性。例如豌豆的豆清蛋白(leguimin)基因可在转化植物种子中特异性表达。
马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因在块茎中优势表达。RubisoN亚基和叶绿素a/b结合蛋白基因受到光的调控。蛋白酶抑制基因在植物被昆虫取食之后进行表达。与番茄成熟有关的蛋白质只在番茄成熟过程中才表达。
在构建植物表达载体时要根据研究工作的目的选择合适的启动子,需要目的基因在植物各个部位各个时期都表达,就选用组成型启动子,需要在特定组织表达就选择组织特异性表达启动子。需要目的基因在特定时间或特定条件下表达就选择发育特异启动子或诱异型启动子,构建好植物载体。
3、植物转基因技术
植物的转基因是指将目的基因转化进入植物细胞并整治的技术。转移途径可分为两类,一种是载体法,即利用改造的农杆菌的天然转化植物系统;另一种是直接转化方法,通过直接对植物受体进行遗传转化的方法,因而适用较载体法要广,本文将着重介绍常用的三种转基因方法。
(1)载体法
根癌农杆菌(Agrobacterium Tumaficiens以下简称A。t。)和发根农杆菌(Agrobacterium Rhizogenesis以下简称A。r。)是一种天然的载体系统,它们共属于根瘤菌属,革兰氏阴性菌。
它可将自己的一部分DNA(T-DNA)转移给植物,进而转化植物细胞,并进行再生。A。t。所含质粒是Ti质粒,A。r。所含质粒是Ri质粒。在Ti质粒和Ri质粒中除了复制起始位点外,有最重要的两个区T-DNA区和Vir区,T-DNA区上的T-DNA可整合进植物基因组中,而且侵染植物后,使植物产生一种正常植物不能合成的特殊氨基酸——冠瘿碱,而Vir区是T-DNA的反式作用因子。
在转化早期农杆菌的染色体Chv区及农杆菌质粒的Vir区起重要作用,染色体Chv区上两个位点即ChvA(1。5KB)及ChvB(5KB)连锁在一起,与农杆菌附着到植物细胞上有关,而Vir区与T-DNA的加工与转移有主要作用,T-DNA是通过Vir区反式作用(trans-acting)进入宿主细胞内而整合表达起作用的。
另外T-DNA在加工与转移过程的单链形式整合到植物体染色体DNA上。
利用农杆菌转移外源基因的过程一般是:(1)将目的基因导入具有T-DNA限制性内切酶酶切段的中间载体或二元载体。(2)将带有目的基因的中间载体或二元载体导入农杆菌。
(3)利用上述菌液感染寄主(受体)植物细胞。(4)诱导筛选检测再生植株。
中间载体法(共整合载体法):首先将外源基因克隆到Ecoli的质粒上,在外源基因的两端构建与农杆菌中的T-KNA两端相同的序列,经过细胞内同源重组,将外源基因整合到农杆菌的T-DNA上,形成共整合载体,用以转化植物。
二元载体法:利用Vir区和T-DNA区(具25BP重复序列)分别构建两个独立的复制子,由Vir区基因群反式作用,可将带有外源基因的T-DNA整合到受体染色体DNA上。
现在通过载体法已从烟草、牛角花、番茄、大豆、苜蓿、菜豆、甜菜、曼陀罗、金鱼草、胡萝卜、拟南芥等植物中获得大量植株。
该方法转化率高,但适用范围窄,大多用于双子叶植物。
(2)花粉管道法
这是我国科学家周光宇创造的一种转基因方法。此法操作简单,但频率低。花粉落于柱头并萌发后,使形成天然的通向子房的通道,将外源DNA涂于授粉的柱头,或将柱头剪去一部分,直接滴于剪去的伤口处,然后外源DNA沿花粉管能道或传递组织,通过珠心进入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。
但授粉后的时间要掌握好,因为时间太短,花粉管不能萌发到子房处,太长花粉管后会形成胼胝塞,使DNA不能进入子房内。该方法简单,易于操作,但转化率低。现已在大豆、水稻、番茄、烟草等作物上成功。
(3)基因枪法
80年代中期,一种新的基因导入方法——基因抢法诞生了,该法又称粒子轰击(particle bombardment),高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment),是由美国Comel大学生物化学系John。
C。Santord等于1983年研究成功。并在1987年,Vlein首先报道了应用此技术将TMV(烟草花叶病毒)RNA吸附到钨粒表面,轰击洋葱表皮细胞,经检测发现病毒RNA能进行复制,并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因导入洋葱表皮细胞。
现在,该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功。
这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。
其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒(金粒或钨粒),将DNA吸附在表面,以一定的速度射进植物细胞,由于小颗粒穿透力强,故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组,从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广,方法简单,转化时间短,转化频率高,实验费用低等优点。
对于农杆菌不能感染的植物,采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。
4、转基因植株后代的筛选
转基因植株基因能否表达。
还要对其进行筛选。这需要区分转化的植株或细胞,为了能更早地筛选转基因植株或细胞,在构建载体时,将一些具有特殊标记的报告基因构建到载体上,也可用分子生物学方法进行检测,例如分子杂交,包括点杂交(Dot Blot),Southem Blot,,Northem Blot,Westem Blot和PCR技术等方法。
报告基因能在转基因的前期就可初步检测,而且检测方法简单,根据后代表型是否具有这种特性来决定是否为转基因植物。加入对一些抗生素或除草剂的抗性基因是当前应用较为普遍的标记基因,例如从细菌中提出的NptⅡ基因(抗km、G418、Neo),Hpt(抗Hyg),Spt基因(抗Strep),Spe基因(抗Spe),突变aroA基因(抗glyphosae),Bar基因[抗PPT(Phosphinothricin)],突变ALS基因(抗Chlorsulfurom)。
也可在其中构建一些易检测的基因如NOS基因,OCS基因,GUS基因,LUC基因等等。这些基因易检测,操作简便,常常在构建载体时构建。
这些方法虽然在前期可初步筛选是否为转基因植物,但并不能完全证明基因的有效表达。
最终验证基因是否有效表达,还要对其所控制的性状进行检测。导入抗病毒基因,可进行血清学检测或常规的病毒接种试验;导入抗除草剂基因,可直接喷洒除草剂;导入耐贮基因,可观察其货架寿命;品质改良,可检测其品质,等等。
这些方法不仅能决定基因是否能有效表达,而用能决定基因能高效表达。
转基因植株是否稳定,还对其后代跟踪调查,看其稳定性,保证转基因植物的有效性
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