小量的基因组DNA提取实验,谁帮
植物组织提取基因组DNA
、材料
幼嫩叶子
二、设备
移液器冷冻高速离心机台式高速离心机水浴锅陶瓷研钵50ml离心管(有盖)及5ml和1。5ml离心管弯成钩状小玻棒
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris·Cl, pH8。 0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1。5% SDS
2、提取缓冲液Ⅱ:18。6g葡萄糖6。9g二乙基二硫代碳酸钠6。0gPVP240ul巯基乙醇加水至300ml
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、 RnaseA母液
5、其试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液无水乙醇、70...全部
植物组织提取基因组DNA
、材料
幼嫩叶子
二、设备
移液器冷冻高速离心机台式高速离心机水浴锅陶瓷研钵50ml离心管(有盖)及5ml和1。5ml离心管弯成钩状小玻棒
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/L Tris·Cl, pH8。
0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1。5% SDS
2、提取缓冲液Ⅱ:18。6g葡萄糖6。9g二乙基二硫代碳酸钠6。0gPVP240ul巯基乙醇加水至300ml
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、 RnaseA母液
5、其试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc
四、操作步骤:
1。
50ml离心管加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热
2。 幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 研钵加液氮磨成粉状立即倒入预热离心管, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 时摇动
3。
加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时重新混匀)
4。 室温下5000rpm离心5分钟
5。 仔细移取上清液至另50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温放置片刻即出现絮状DNA沉淀
6。
1。5ml eppendorf加入1ml TE用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,干净吸水纸上吸干,转入含TE离心管,DNA快溶解于TE
7。 DNA形成絮状沉淀,则用5000rpm离心5分钟, 再沉淀移入TE管样收集沉淀,往往难溶解于TE,60℃水浴放置15分钟上帮助溶解
8。
DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净5ml离心管
9。 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA操作、分析般无影响省略该步骤)
10。
加入1/10体积3mol/L NaAc及2×体积冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀
11。 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再干净吸水纸上吸干
12。 DNA重溶解于1ml TE, -20贮存
13。
取2μl DNA样品0。
7% Agarose胶上电泳, 检测DNA分子大小同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量
[注意] 5g样品保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。收起