mtt培养液配置需要酚红吗
MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。 二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 它的特点是灵敏度高、经济。
介绍 编辑本段
又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞...全部
MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
介绍 编辑本段
又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
原理 编辑本段
四唑盐(MTT)商品名为噻唑蓝,化学名为3-(4,5)-2-唑噻-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝。可透过细胞膜进入细胞内,活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中,而死细胞没有这种功能[1]。
二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色的深浅与所含的Formazan量成正比。用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值(OD值),可间接反映细胞数量。
缺点
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由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法 编辑本段
通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT 0。
5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中,用0。22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。
注意事项 编辑本段
1。
选择适当得细胞接种浓度。保证终止培养时不致细胞过满和MTT结晶形成量与细胞数呈良好的线性关系。
2。 由于培养基中血清、酚红颜色影响测定孔的光吸收值,降低了试验的敏感性。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
3。 设空白对照孔。试验中设不加细胞只加培养液的空白对照孔,其操作与实验组一致。最后比色时,以空白对照孔调零。
4。MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0。
7 范围内,超出这个范围就不是直线关系。
5。MTT一般最好现用现配,过滤后4℃避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
6。MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套。
配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。
7。配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配,60℃水浴助溶。
8。PBS配方: Nacl 8g Kcl 0。2g Na2HPO4 1。44g KH2PO4 0。24g 调pH 7。4 定容1L
实验步骤 编辑本段
贴壁细胞
1、收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。
2。、5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药。一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔。
建议设5个,否则难以反应真实情况 3。、5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。 4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0。5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。
5、终止培养,小心吸去孔内培养液。 6、每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。 7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
悬浮细胞
1、收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 lg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。
每板设对照(加100(储存液100 1640)。 2、置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。 3、每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0。5%MTT),继续培养4 h。
(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值) 4、离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。 5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
培养细胞活力检测(MTT法)
http://www。biojie。com/html/xibaojishu/2013/0619/1869。html。收起