具有催化作用的RNA属于哪种RNA?
70年代后期以来,Altman及Cech等发现RNaseP的RNA亚基和嗜热四膜虫的前体rRNA中的居间序列(Intervening sequence.IVS)都具有酶的催化活性,经过10年来的研究业已证明,RNA是一种兼有遗传信息的存贮与传递及生物催化功能的生物大分子,这是人们对RNA分子功能认识的一个重大突破。
(一)RNaseP中的RNA亚基的催化功能
1978年,Altman在纯化RNaseP时,发现一种377个核苷酸长的RNA片段与一种14000道尔顿的蛋白质总是同时被纯化,另外,还发现RNaseA及小球菌核酸酶都可使RNaseP失活,RNaseP的浮力密度显示RNA——蛋白...全部
70年代后期以来,Altman及Cech等发现RNaseP的RNA亚基和嗜热四膜虫的前体rRNA中的居间序列(Intervening sequence.IVS)都具有酶的催化活性,经过10年来的研究业已证明,RNA是一种兼有遗传信息的存贮与传递及生物催化功能的生物大分子,这是人们对RNA分子功能认识的一个重大突破。
(一)RNaseP中的RNA亚基的催化功能
1978年,Altman在纯化RNaseP时,发现一种377个核苷酸长的RNA片段与一种14000道尔顿的蛋白质总是同时被纯化,另外,还发现RNaseA及小球菌核酸酶都可使RNaseP失活,RNaseP的浮力密度显示RNA——蛋白质复合物特性,在离体条件下,大肠杆菌RNaseP的RNA亚基与蛋白质亚基都不表现RNase活性,但若把RNA亚基与蛋白质亚基进行重组,则重组复合物具有RNA酶活性。
更进一步的研究发现,RNaseP的RNA亚基可在高Mg2+浓度下,催化前体tRNA的剪切,而蛋白质亚基则无此功能,从而说明RNaseP的催化功能是由其RNA亚基部分来承担的。
RNaseP是一种核酸内切酶,在形成成熟的tRNA时,用以切除tRNA前体5’端附加顺序。
大肠杆菌的RNaseP可裂解60余种不同的前体tRNA,并均作用于特定的磷酸二酯键上,而这些被切除部位的核苷酸顺序之间却是非同源的。现已在大肠杆菌、枯草杆菌等原核生物及某些真核生物细胞中发现RNaseP的存在及其RNA亚基在前体tRNA剪接中的生物催化功能。
Altman曾研究发现用RNaseP的RNA亚基裂解前体tRNA时,在琼脂糖胶上有RNA亚基二聚体存在,而用RNaseP催化同一反应时,则未能检出这种二聚体。更早一些的实验还发现,在高Mg2+浓度下,聚乙二醇(PEG)可提高RNaseP的RNA亚基的催化活性,说明PEG可促使RNA亚基二聚体的形成,并且RNA亚基在PEG或蛋白质的不同存在条件下,其催化反应中的自身构象亦不相同。
Altman等在研究RNA亚基3’端5’端核苷酸缺失与其催化活性关系中,发现随3’端5’端不同核苷酸数的缺失,RNA亚基的催化活性亦随之而降低,乃至失活,这说明RNA亚基分子折叠所形成的三维空间结构可能是其催化活性的重要保证。
大肠杆菌的4。5sRNA前体可被RNA亚基剪切,但如果当有蛋白质亚基存在时,则剪接速度可加快几百倍以上。另外,RNA亚基对3’端带CCA顺序的前体tRNA比对3’端CCA顺序缺失的前体tRNA的裂解效率更高,但当有蛋白质亚基存在时,则剪接这两类前体tRNA的效率几乎相同,这说明蛋白质亚基决定着RNaseP全酶对不同底物的剪接效率,可能对RNA亚基功能起着某种调控作用。
到目前为止,已充分肯定了RNaseP的催化活性中心在RNA亚基上,但有关RNaseP与前体tRNA的识别位点及剪接机制还不完全清楚。
(二)四膜虫rRNA前体的自我剪接
1981年Cech发现原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)的大核26srRNA基因中有一段内含子,该基因转录产物——前体rRNA中相应于这段内含子的核苷酸顺序是一个有413个核苷酸的居间序列(IVS)。
在前体rRNA加工过程中,这个IVS可自我催化切除,并最后使5’→外显子与3’→外显子连接成成熟的rRNA分子。
在离体条件下,四膜虫大核rRNA前体可在没有蛋白质存在下,由Mg2+和鸟苷或5’鸟苷酸作辅助因子,完全催化剪接过程。
为了证明剪接过程中,确实没有蛋白质参与,曾用重组DNA技术得到四膜虫rRNA基因中的413bP连同两侧的DNA克隆片段,将其离体转录出相应的RNA,再进行SDS-酚抽提,以保证转录产物前体rRNA不与酶蛋白结合,在电泳图谱上可看到环状IVS,线状IVS和缺失15个核苷酸的线状物3条谱带,结合其他一些实验结果,可以充分肯定前体rRNA可在非酶蛋白质存在条件下进行自我剪接。
四膜虫rRNA前体的自我催化剪接过程是由两步转磷酸酯反应完成的,反应中,不需要外源ATP或GTP提供能量。首先,在Mg2+存在下,鸟苷或5’鸟苷酸的3’—OH作亲核试剂攻击IVS的5’—剪接位点,使鸟苷或鸟苷酸的3’—OH与IVS的5’—磷酸共价连接,之后,5’—外显子中3’端的羟基作亲核试剂攻击IVS的3’—剪接位点,经转磷酸酯反应使5’—外显子通过UpU共价相连,得到成熟的rRNA,切除的IVS3’端鸟苷的3’—OH攻击IVS5’端邻近的磷酸二酯键,使IVS5’端的15个核苷酸片段缺失,而形成一个由3’—5’磷酸二酯键相连的环状分子。
通过核苷酸顺序分析,发现四膜虫大核rRNA前体的IVS有6段保守顺序为:(5’)qR′—A—B—qL—qR—2(3’),而且,A与B,qL与2,qR与qR’相互配对,使IVS折叠成一定的二级和三级结构,结合IVS内的位点专一突变或小段缺失和与IVS互补的寡聚脱氧核苷酸以及高温、高浓度变性剂都将导致IVS催化活性的丧失等事实,说明IVS的催化活性可能由其自身的某种特定的精确三维空间结构所确定。
Cech等(1986年)进一步研究证明四膜虫大核rRNA前体自我剪接后所形成的环状IVS可水解成一个比完整IVS少了5’端19个核苷酸的线状IVS称为L-19IVS,在离体条件下,L-19IVS可催化五聚胞苷酸形成多聚胞苷酸,说明L-19IVS具有核苷酸转移酶、磷酸二酯酶、磷酸转移酶、酸性磷酸酯酶和RNA限制性内切酶等5种酶活性。
对大量真核生物RNA前体的剪接方式进行研究的结果表明,有许多RNA前体的剪接并不需要酶蛋白质参与,而由IVS自我催化完成,根据这些IVS的结构及剪接方式,可将这些RNA分为两类。
第一类,IVS结构与四膜虫大核rRNA前体的IVS相似,剪接方式也一样,反应需要鸟苷或5’鸟苷酸和Mg2+作辅助因子。第二类,IVS的结构不同于第一类,剪接时不需要鸟苷或5’鸟苷酸,但需要Mg2+参与反应,最后使IVS形成套索结构而被除去。
RNA催化功能的发现使人们对生物催化反应、酶的本质以及RNA功能的多样性的研究进入了一个新天地。现在,又相继发现植物病毒RNA、大肠杆菌T4噬菌体mRNA的自我催化剪接作用。
RNA的催化反应还有许多问题需要进行更深入地研究。
(《生物学通报》1994年第3期)。收起