糖的色谱分离方法及原理有哪些？
糖的色谱分离方法及原理如下：
(1)高效液相色谱法在淀粉糖行业,糖浆分析是日常很重要的工作之一，在 工厂中最常用的仪器分析方法是高效液相法（HPLC)。在HPLC分析糖的方法中， 主要有空间排斥色谱法、分配色谱法、配位体交换色谱法和阴离子色谱法。 空间排 斥色谱法主要是基于被分离物质分子质量的差异，可分为适合于有机溶剂的凝胶 渗透色谱和水溶性的物质分离的凝胶过滤色谱。这两种分离方法主要适合于大分 子质量物质的分离,例如淀粉分子质量分布可使用凝胶过滤色谱测定。 分配色谱 法是基于糖在固定相和流动相中的分配系数不同，目前市场上的色谱柱主要是以 硅胶键和氨丙基的填充剂为固定相，流动相为乙腈-...全部
糖的色谱分离方法及原理如下：
(1)高效液相色谱法在淀粉糖行业,糖浆分析是日常很重要的工作之一，在 工厂中最常用的仪器分析方法是高效液相法（HPLC)。在HPLC分析糖的方法中， 主要有空间排斥色谱法、分配色谱法、配位体交换色谱法和阴离子色谱法。
空间排 斥色谱法主要是基于被分离物质分子质量的差异，可分为适合于有机溶剂的凝胶 渗透色谱和水溶性的物质分离的凝胶过滤色谱。这两种分离方法主要适合于大分 子质量物质的分离,例如淀粉分子质量分布可使用凝胶过滤色谱测定。
分配色谱 法是基于糖在固定相和流动相中的分配系数不同，目前市场上的色谱柱主要是以 硅胶键和氨丙基的填充剂为固定相，流动相为乙腈-水混合液。此种方法流动相 中乙腈和水的比例对于分离有重要影响,通常减小流动相中的水比例，二糖、三糖 中的同分异构体可以获得较好的分离效果，但分离时间较长,而增加水的比例可以 缩短分析时间并可分离更高分子质量的糖，但会牺牲二糖、三糖同分异构体之间的 分离。
此种方法可以分离麦芽糖、异麦芽糖、潘糖、麦芽三糖、异麦芽三糖，同时还 可以分离麦芽四糖、麦芽五糖，因此在国标中采用此方法分析低聚异麦芽糖。该法 的缺点是流动相中使用有毒且昂贵的乙腈。配位体交换法是基于负载在树脂基质 上的金属离子与糖所形成的络合物的稳定性不同实现不同糖类的分离，常用的金 属抗衡离子有Ca2+、Na+、Pb2+、Ag+等，适合于单糖及糖醇的分离。
此种方法使用 水作为流动相，同时为了避免对映体的干扰，分离须在高温下进行（通常80℃）。 阴离子交换色谱法分析糖类主要有两种方式，一是基于弱电解质的糖可在pH12以 上的溶液中电离，可通过梯度洗脱进行分离，此种方式已成为糖分析中非常有力的 一种方法，有专门的色谱设备;另一种则是通过糖与硼酸形成络合物，此络合物在 不同pH的溶液中电离度不同，通常采用PH梯度洗脱进行分离。
此种方法适合不 同结构的单糖及二糖分析。这几种分离方法并不是完全独立的，目前市场上推出 的很多色谱柱综合了多种分离方式，例如在果糖行业中使用较多的Bio - rad Aminex色谱柱对于单糖到多糖的分离依靠空间排斥法（通常可分离的最大聚合度 为4)，而对果糖和葡萄糖的分离则依赖于配位体交换。
HPLC分析中可使用的检测器很多，如紫外吸收检测器、示差折光检测器、质谱 检测器及电化学检测器等，但糖分析最常使用的检测器是示差折光检测器。这种 检测器存在的主要问题是对被分析物质无选择性，灵敏度较紫外检测器低，但近年推出的高灵敏度型可将糖类检测限降至lOOng。
蒸发光散射检测器是另一种可用 于糖类检测的高灵敏度通用型检测器，它对葡萄糖的检测限可达2ng,适合于任何 挥发性低于流动相的样品检测，并且可检测梯度洗脱样品。但与示差折光检测器 相比价格昂贵，并且需要使用气体,且在检测过程中会产生废气，目前此种检测器 还未在行业中推广应用。
(2)高效阴离子交换色谱-脉冲安培法近年来糖的分析有很大发展，特别 是离子色谱应用到糖的分析中，使得分析水平大大提高。对于大部分糖而言，均属 于中性糖，P&在12 ~ 14,在中性溶液中其并不会电离，但在碱性溶液中，当pH大 于糖的P&时，糖会部分或全部解离，以阴离子形式存在于溶液中，可吸附在阴离 子交换树脂上。
洗脱液中的NaOH扮演着双重角色，既为糖的电离提供碱性环境， 同时也是洗脱剂，当溶液pH未达到糖的时，增加NaOH的浓度，糖不断解离从 而与阴离子结合能力加强,表现为保留时间增加，但高pH所带来的洗脱离子强度 又会使保留时间减少。
当糖未完全解离时，这两种作用互相影响，当糖完全解离 时，增加NaOH浓度,保留时间减少。在流动相中加入醋酸钠（NaAc )，由于Ac_对 固定相的亲和力大于OH-，因此可以提高对强吸附糖的洗脱能力。
由于糖只能在 碱性条件电离，并且需要梯度洗脱，配备金电极的脉冲安培检测器能够实现这一分 离过程中糖的检测。由于糖分子中的羟基易被氧化，可以金电极表面施加电位使 其氧化产生氧化电流作为检测信号，这种方法又被称为高效阴离子交换色谱-脉 冲安培法（HPAEC - PAD)。
采用HPAEC - PAD分析糖类，单糖和二糖在色谱柱上 的保留行为与其结构相关，而多糖在色谱柱上的保留行为与聚合度及糖苷键类型 有关，随着聚合度的增加，分子中羟基的数目增多，其在色谱柱上的保留也越强，因 此需要较高浓度的NaAc进行洗脱。
采用此种方法分析商品糊精，可分离的最大聚 合度可达40,分析淀粉液化液，可检测到聚合度达17的多糖。此外，此种方法非常 适合糖的同分异构体的分析，特别是糖化过程中逆反应产物异麦芽糖、麦芽酮糖、 潘糖、曲二糖等的分析。
(3)毛细管电泳法毛细管电泳法也可用于糖的分析，但在谷物加工中，所产 生的糖主要为中性糖，不能直接通过电泳法进行分析，需要通过络合、解离或是衍 生等方法使其带电，从而实现其在电场中的分离。
在众多使糖带电的方法中，适当 的衍生方法不但能够使中性糖带电，还能提高检测灵敏度。许多芳香胺类化合物 既有紫外吸收又能够发射荧光，是一类非常好的衍生试剂。其中采用9 -氨基芘 -1，4,6 -三磺酸（APTS)对糖进行衍生具有独特的优势，同时采用激光诱导荧光 检测器（LIF)检测时，是非常灵敏的分析方法。
APTS含有3个磺酸基，使其既能在 碱性也能在酸性条件下电离，在碱性条件下电离，能够区分糖的结构差异，适合于 同分异构体的分离，而酸性条件则能按照分子质量进行分离。采用此种方法分析 木糖基多糖最大聚合度可达键合的葡聚糖为18。
杰能科谷物应用实 验室以10mmol/L,pH 2。9的磷酸缓冲液为分离缓冲液分析糊精APTS衍生物，可在25min之内完成聚合度达到45的多糖分析。CE-LIF也可以分析糖的同分异 构体，淀粉水解过程中的逆反应产物异麦芽糖、潘糖、曲二糖、黑曲霉糖及纤维素降 解产物纤维二糖、龙胆二糖等都可以用APTS衍生进行分析。
但由于此方法是 APTS与糖的还原端进行衍生化反应，因此并不适合于非还原糖如海藻糖的检测。 此外,一些研究也发现,APTS对果糖的衍生效率远低于对其他糖，因此当样品中含 有少量果糖时，其很难被检测到。
除了果糖外，我们在分析过程中发现，含有果糖 基的麦芽酮糖、水苏糖也可用此方法进行分析。在进行同分异构体分离时，如利用 CE法分析低聚异麦芽糖，采用a -萘胺对低聚异麦芽糖进行衍生，使用75mmol/L 的硼砂（PH10。
5)为分离缓冲液，进行紫外检测，可以检测到样品中含有葡萄糖、麦 芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖和潘糖。杰能科谷物应用实验室以50mmoI/L的硼砂 (PH9。 6)为分离缓冲液对低聚异麦芽糖的APTS衍生物进行分离可在30min内实 现葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖、异麦芽四糖、异麦芽五 糖、异麦芽六糖、异麦芽七糖、曲二糖、黑曲霉糖的分离。
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