淋巴细胞亚群的分离怎么做？
分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。 常用以下几种方法：
（一）E花环沉降法
本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。
（二）尼龙毛分离法
本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细...全部
分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。
常用以下几种方法：
（一）E花环沉降法
本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。
（二）尼龙毛分离法
本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。
用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。
（三）亲和板结合分离法
利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。
同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。
用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。
图20-3 亲和分离法图解
（四）荧光激活细胞分离仪分离法
荧光激活细胞分离仪（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理系统，④细胞分选系统。
其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。
如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管。用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段。
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