DGGE条带 为什么进行克隆测?
用灭菌的手术刀片将不同迁移率的DGGE条带尽可能多的进行切割,放入含40 μl无菌ddH2O的EP管中,4℃过夜,以1 μl 该溶液为模板,以不加GC夹的相应引物进行PCR扩增,扩增体系和程序参照之前加GC夹条件差不多。 重新扩增的PCR产物与pMD19-T Simple vector (Takara Bio- technology (Dalian) Co。 Ltd。, Dalian, China) 进行连接,采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,从涂布有Amp (100μg•ml-1)、X-gal (20μg•ml-1)和IPTG (40μg•ml-1)的LB平板挑选含有重组子...全部
用灭菌的手术刀片将不同迁移率的DGGE条带尽可能多的进行切割,放入含40 μl无菌ddH2O的EP管中,4℃过夜,以1 μl 该溶液为模板,以不加GC夹的相应引物进行PCR扩增,扩增体系和程序参照之前加GC夹条件差不多。
重新扩增的PCR产物与pMD19-T Simple vector (Takara Bio- technology (Dalian) Co。 Ltd。, Dalian, China) 进行连接,采用热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,从涂布有Amp (100μg•ml-1)、X-gal (20μg•ml-1)和IPTG (40μg•ml-1)的LB平板挑选含有重组子的白色菌落,以pMD19-T Simple 载体上的RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACA- CAGG 和 M13-47 (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC) 为引物,验证阳性克隆。
25 μL PCR反应体系为10 × Taq DNA polymerase buffer 2。5 μL,25 mM MgCl2 1。5 μL,引物RV-M和M13-47 (10μM)各0。5 μL,2。
5 mM dNTP 2 μL,5 U/μL Taq酶 0。15 μL,大肠杆菌单菌落为模板,ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为:94℃ 预变性 5 min;94℃变性0。5min,54℃退火0。
5 min,72℃延伸1。5min,循环30次;72℃延伸5min,1。2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。挑取阳性克隆子送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。测定的16S rDNA V3区序列在GenBank数据库中进行比对,并申请序列登陆号。
收起