请叙述DNA和蛋白质印迹技术的基
印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样
品的一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用
DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法,
对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的
蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为
Eastern印迹法。
蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上,通常有
两种方法:毛细管印迹法和电...全部
印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样
品的一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用
DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法,
对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的
蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为
Eastern印迹法。
蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上,通常有
两种方法:毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上,
在凝胶上放一片硝酸纤维素膜,再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好,缓冲液就会
通过毛细作用流过凝胶。
缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上,硝酸纤维素膜
可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜,就可以将凝胶中的
蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但这种方法转移的效率较低,通常只能转移凝胶中一小部分
蛋白质(10%～20%)。
电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和
有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成"三明治"形状,而后浸入两个平行电极中间的缓冲液
中进行电泳,选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。
转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹(blot),用于对蛋白质的进 一步检测。印迹
首先用蛋白溶液(如10%的BSA)处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点,而后用
所要研究的蛋白质的抗血清(一抗)处理,印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合,而其它
蛋白质不与一抗结合,这样清洗去除未结合的一抗后,印迹中只有待研究的蛋白质的位置上
结合着一抗。
处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理,二抗是指一抗的抗体,如一抗是
从鼠中获得的,则二抗是抗鼠Ig G的抗体。处理后,带有标记的二抗与一抗结合,可以指
示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置。
目前有结合各种标记物的抗特定Ig G的抗体
可以直接购买作为标记的二抗。最常用的一种是酶连的二抗,印迹用酶连二抗处理后,再用
适当的底物溶液处理,当酶纯化底物生成有颜色的产物时,就会产生可见的区带,指示所要
研究的蛋白质的位置。
在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷
酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物;而辣根过氧化物
酶可以以H2O2为底物,将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产
物。
另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法,辣根过氧化物酶在H2O2存在
下,氧化化学发光物质鲁米诺(luminol,氨基苯二酰一肼)并发光,在化学增强剂存在下
光强度可以增大1000倍,通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存
在。
除了酶连二抗作为指示剂,也可以使用其它指示剂,主要包括以下一些:
I125标记的二抗:可以通过放射性自显影检测。
荧光素异硫氰酸盐标记的二抗:可以通过在紫外灯下产生荧光来检测。
I125标记金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A):Protein A可以与Ig G的Fc区特异性
的结合,因此Protein A可以代替二抗:I125标记的Protein A通过放射性自显影检测。
金标记的二抗:二抗通过微小的金颗粒包裹,与一抗结合时可以表现红色。
生物素结合的二抗:印迹用生物素结合的二抗处理后,再用碱性磷酸酶或辣根过氧化物
酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝集素紧密结合,这种方法实际上相当于通过生物素与
凝集素的紧密结合将二抗与酶连接,通过酶的显色反应就可以进行检测。
这种方法的优点是
由于生物素是一个小分子蛋白,一个抗体上可以结合多个生物素,也就可以结合多个酶连接
的凝集素,可以大大增强显色反应的信号。
除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外,有时也使用其它探针如放射性标记
的DNA,可以检测印迹中的DNA结合蛋白。
[主要试剂]
1,SDS-PAGE试剂:
2,匀浆缓冲液:1。0M Tris-HCl(pH 6。8)1。Oml;10%SDS 6。0ml;β-巯基乙醇 0。2ml;
ddH2O 2。
8ml。
3,转膜缓冲液:甘氨酸 2。9g;Tris 5。8g;SDS 0。37g;甲醇200ml;加ddH2O定容至
1000ml。
4,0。01M PBS(pH7。4):NaCl 8。
0g;KCl 0。2g;Na2HPO4 1。44g;KH2PO4 0。24g;加ddH2O
至1000ml。
5,膜染色液:考马斯亮兰 0。2g;甲醇80ml;乙酸2ml;ddH2O118 ml。
包被液(5%脱
脂奶粉,现配):脱脂奶粉1。0g 溶于20ml的0。01M PBS中。
6,显色液:DAB 6。0mg;0。01M PBS 10。0ml;硫酸镍胺 0。1ml;H202 1。
0μl。
7,兔抗猪R蛋白抗体,HRP标记羊抗兔IgG(二抗)。
[操作步骤]
1,蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细
胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0。
5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上
清液作为样品。
2,电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。
3,转移(半干式转移):
(1)电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。
(2)膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。
(3)转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板,24层滤纸,NC膜,凝胶,24层滤纸,
阴极碳板的顺序放好,滤纸,凝胶,NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将
碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2,转移1。5hr。转移结束后,断开电源将膜
取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%
甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果
作对比。
4,免疫反应:
(1)用0。01M PBS洗膜,5min ×3次。
(2)加入包被液,平稳摇动,室温2hr。
(3)弃包被液,用0。01M PBS洗膜,5min×3次。
(4)加入一抗(按合适稀释比例用0。
01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放
置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。
(5)弃一抗和1%BSA,用0。01M PBS分别洗膜,5min×4次。
(6)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0。01M PBS稀释),平稳摇动,
室温2hr。
(7)弃二抗,用0。01M PBS洗膜,5min×4次。
(8)加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
[注意事项]
1,一抗,二抗的稀释度,作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2,显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2。
3,DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。
。收起
