你好，酸性染料比色法测十大功劳总
建立百合中总生物碱的含量测定方法。方法：采用酸性染料比色法测定总生物碱含量。以秋水仙碱为对照品，溴甲酚绿为酸性染料，在 pH3。6缓冲溶液条件下，用氯仿萃取，于414nm波长处测定其吸光度，并测定了4个产区的百合中总生物碱的含量。 结果：秋水仙碱在 120~200μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为A=0。0019C+0。0014（r=0。9997）；秋水仙碱的平均加样回收率 为（101。8±1。59）%，RSD=1。 57%（n=6）。结论：所建立的总生物碱测定方法简便、准确，为百合质量的控制提供实验依据。
中药百合为百合科植物卷丹（Lilium lancifoliu...全部
建立百合中总生物碱的含量测定方法。方法：采用酸性染料比色法测定总生物碱含量。以秋水仙碱为对照品，溴甲酚绿为酸性染料，在 pH3。6缓冲溶液条件下，用氯仿萃取，于414nm波长处测定其吸光度，并测定了4个产区的百合中总生物碱的含量。
结果：秋水仙碱在 120~200μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为A=0。0019C+0。0014（r=0。9997）；秋水仙碱的平均加样回收率 为（101。8±1。59）%，RSD=1。
57%（n=6）。结论：所建立的总生物碱测定方法简便、准确，为百合质量的控制提供实验依据。
中药百合为百合科植物卷丹（Lilium lancifolium Thunb。）、百合 （Lilium brownii F。
E。Brownii var。viridulum Baker）或细叶百合 （Lilium pumilum DC。）的干燥肉质鳞叶，味甘、寒，归心、肺经，具有养阴润肺、清心安神之功效[1]。现代医药学研究证实，百合除了具 有镇咳、平喘、祛痰、助眠、抗疲劳、耐缺氧等功效外，还具有较好的抗肿瘤活性，其抗肿瘤的主要活性成分为生物碱类成分[2]，包括秋水仙碱，以及与秋水仙 碱结构相似的卓酚酮类生物碱。
但目前尚未有其含量测定的研究，因此有必要对百合中所含的总生物碱进行含量测定。本研究采用酸性染料比色法，以秋水仙碱为对 照品，建立了百合中主要成分总生物碱的含量测定方法，并对江苏宜兴、甘肃兰州、浙江湖州、湖南龙山四大产区百合中的总生物碱进行了含量测定，为更好地控制 百合质量，使其充分发挥抗肿瘤药效提供实验依据。
1·仪器、试剂与材料
UV-2802型紫外可见分光光度计（龙尼柯上海仪器有限公司）；METTLER TOLEDO分析天平、十万分之一分析天平、 METTLER TOLEDO 320 pH计（METTLER TOLEDO分析仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂）。
秋 水仙碱对照品（纯度>99%，购于中国药品生物制品检定所）；百合药材，均购于安徽亳州药材有限公司（产地：湖南龙山20110523，甘肃兰州 20110523，经鉴定为百合科植物百合；江苏宜兴20100809，浙江湖州20110523，经鉴定为为百合科植物卷丹），其余试剂均为分析纯。
醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3。6）：取醋酸钠5。1g，加冰醋酸20mL，再加水稀释至250mL，即得[1]。
0。05%溴甲酚绿酸性染料的配制：精密称取溴甲酚绿0。05g，加pH3。
6醋酸-醋酸钠溶液溶解至100mL，摇匀，即得。
2·方法与结果
2。1对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的秋水仙碱对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用pH 3。6醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并稀释定容 至刻度，摇匀，即得浓度为0。
2mg/mL的秋水仙碱对照液。 2。2供试品溶液的制备精密称取百合粉末1。0g置于干燥的100mL圆底烧瓶中，加 入pH 3。6醋酸-醋酸钠缓冲液50mL，加热回流提取1h，离心，抽滤，滤液减压浓缩后，定容至25mL，即得供试品溶液。
2。3测定波长的选择精密吸取秋水仙碱对照液与百合供试品溶液各3mL，置于分液漏斗中，分别精密加入溴甲酚绿5mL，再加入氯仿10mL，振摇 3min，静置30min，分取氯仿层，并加入0。
5g无水硫酸钠，放置0。5h。另取醋酸-醋酸钠缓冲液3mL，同法操作，所得氯仿液为随行空白液。分 别在400～700nm波长范围内进行扫描。结果表明，秋水仙碱对照液和百合供试品溶液在414nm处均有最大吸收，故选择414nm为检测波长。
2。4标准曲线的制备精密吸取秋水仙碱对照液0。0、0。9、1。2、1。5、1。8、2。1、2。4、3。0mL，置于分液漏斗中，再分别补加 3。0、2。1、1。8、1。5、1。2、0。
9、0。6、0。0mL醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 3。6），精密加入溴甲酚绿5mL，再分别加入氯仿 10mL，振摇3min，静置30min，分取氯仿层，并加入0。5g无水硫酸钠，放置0。5h。以醋酸-醋酸钠缓冲液3mL为随行空白对照，于 414nm处依法测定吸光度。
以秋水仙碱对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 A=0。0019C+0。0014（r=0。9997），结果表明，秋水仙碱的质量浓度在120~200μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
2。5精密度试验精密量取0。2mg/mL秋水仙碱对照液3。0mL，置于分液漏斗中，参照“2。4”项下方法操作，于414nm处依法测定吸光度，连续测定6次。结果RSD=0。79%，说明仪器所测数据准确可靠。
2。6重复性试验精密称取湖南龙山百合（批号：20110523）粉末6份，各1。0g，按“2。2”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液 3。0mL，置于分液漏斗中，按“2。4”项下方法操作，于414nm处依法测定吸光度，计算其平均含量为0。
627%，RSD为0。84%。结果表明， 该方法重现性良好。
2。7稳定性试验精密吸取“2。2”项下制备的供试品溶液3。0mL，按“2。4”项下方法操作，显色后分别在0、5、10、20、30、40、50min于414nm处依法测定其吸光度。
RSD为0。56%，表明其在50min内稳定。
2。8加样回收率试验精密吸取6份已知浓度的供试品溶液各1。5mL，分别精密加入1。5mL秋水仙碱对照品溶液（浓度为 0。250mg/mL），混匀，比色测定吸光度。
根据回归方程计算回收率。秋水仙碱的回收率为（101。8±1。59）%（n=6），结果见表1。
2。9百合中总生物碱的含量测定取江苏宜兴、甘肃兰州、浙江湖州和湖南龙山产地的百合饮片，分别按“2。
2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供 试品溶液3。0mL，置于分液漏斗中，按“2。4”项下方法操作，于414nm处依法测定吸光度。根据标准曲线计算百合总生物碱的含量，结果见表2。
3·讨论
经查阅，2010版《中国药典》中仅记载有百合药材的鉴定方法，并未有其相关的定量指标。
生物碱类成分是百合主要的抗肿瘤活性成分。然而，除了秋 水仙碱外，百合中与秋水仙碱具有相同结构的卓酚酮类生物碱也具有较好的抗癌活性，且秋水仙碱在药材中的含量低，若仅以秋水仙碱作为含量测定指标，并不能代 表整个药材的抗肿瘤活性成分。
因此，选择总生物碱为检测指标，以秋水仙碱为对照品，采用酸性染料比色法测定百合中总生物碱的含量，从而建立百合含量测定指 标。笔者运用此方法，对江苏宜兴、甘肃兰州、浙江湖州和湖南龙山产地百合中的总生物碱分别进行了含量测定，由测定结果得知，百合总生物碱的含量在 0。
438%～0。749%，其中以甘肃兰州产地居高，江苏宜兴最低。
酸性染料比色法是一种测定总生物碱含量的较好方法，灵敏度高，专属性较好。酸性染料比色法对实验条件的要求较为严格，选择合适的测定条件是关键。
在总生物碱含量测定时，缓冲溶液pH、酸性染料用量和氯仿用量是显著的影响因素。本试验分别考察了pH=3。2、3。4、3。6、3。8、4。0的醋酸- 醋酸钠缓冲溶液、用量为3。0、4。0、5。0、6。
0、7。0mL的酸性染料和用量为3。0、5。0、10。0、15。0、20。0mL的氯仿溶液对生 物碱与酸性染料结合程度及其络合物被萃取程度的影响。依据测定吸光度值的大小，最终确定缓冲溶液pH3。
6、酸性染料用量5。0mL、氯仿用量 10。0mL为酸性染料比色法测定百合总生物碱的最佳萃取显色条件，并且在实验过程中严禁在氯仿萃取液中混入水分，否则会使溶液变浑浊，影响比色结果。故 在测定吸光度前，必须用脱水剂（如无水硫酸钠）除去萃取溶剂中的水分。
此外，实验中发现溴甲酚绿显色剂放置一段时间后会不稳定，因此显色剂应现用现配。从 而可以保证测定结果准确、可靠、稳定。
在实验过程中，以总生物碱的含量高低为指标，对百合中总生物碱的提取方法（包括乙醇回流、氯仿超声、酸水超声、酸水回流）进行了考察。
经测定发现，采用酸水回流提取的方法，可使百合中的总生物碱成分提取完全，从而有利于百合充分发挥抗肿瘤的药效。
。收起
