器官移植免疫耐受诱导的方法包括哪些

    朋友您好，我以皮肤移植为例，皮肤移植是救治大面积烧伤。严重创伤的关键措施之一，虽然自体皮肤移植是覆盖全厚皮肤缺损创面的最好方法。然而，大面积烧伤患者的自体皮源常常不足，不得寻求其它生物敷料，具有机械性和生理性保护作用的异体皮是目前较好的生物敷料[1]，目前脱细胞真皮基质( allogenic acellular dermal matrix ,allo-ADM) [2，3] ,及异种(猪) 脱细胞真皮基质(xenogenic acellular dermal matrix , xeno-ADM) 已在临床应用[4 －7 ]，但异体皮在移植后因机体的排斥反应而不能长期存活。
    本文就皮肤排斥有关方面机制，尤其是在临床易于检测到的细胞因子与免疫排斥及耐受关系进行简要综述。 一、器官移植的免疫学基础。 器官移植在二十世纪前除角膜移植外，由于发生排斥反应，大部分是失败的，但是机理一直在探索中，直到20世纪40年代，以英国动物学家、外科医生Medawar为代表的科学家总结前人经验及试验动物学研究后，初步论证了排斥反应本质为一种免疫应答反应，从而奠定了移植免疫学基础。
     在基础免疫中，与器官移植免疫相关的主要包括免疫细胞、免疫分子和移植抗原。【8】 1、免疫细胞泛指参与所有免疫应答及其相关的细胞，包括淋巴细胞、单核/巨噬细胞及其他抗原提呈细胞等。
   淋巴细胞是构成免疫器官的基本单位，其在免疫应答中起核心作用，淋巴细胞是不均一细胞体，包括许多具有不同免疫功能的细胞亚群，T细胞（胸腺依赖性淋巴细胞）和B细胞（骨髓依赖性淋巴细胞）是其中最主要的两大细胞群体。
     T细胞主要是胸腺细胞分化而来，是特异性免疫应答的主力军，它在同种与异种移植物发生免疫排斥反应中起重要作用。T细胞分为CD4 和CD8 T细胞两大亚群。1）CD4 T细胞主要识别组织相容性抗原-Ⅱ类分子结合的外源性多肽抗原，具有辅佐或诱导免疫应答的功能，故称Th细胞。
    1986年，Mosmann等（9）首次发现了CD4 T细胞具有两种功能不同的细胞亚群，即Th1和Th2细胞。1991年Maggie[10]发现人的TH细胞与鼠相似，也可分为Th1和Th2细胞。
  2）CD8 T细胞主要识别组织相容性抗原-Ⅰ类分子结合的外源性多肽抗原，具有杀伤靶细胞的功能。   抗原呈递细胞（APC）是指所有具有抗原呈递功能的细胞，其中最重要的两类抗原递呈细胞为单核/巨噬细胞和树突细胞，这些细胞富含MHC-Ⅱ类分子，通过摄取外源性抗原加工处理成抗原肽并与MHC-Ⅱ类分子结合从而表达至细胞表面，被CD4 T细胞识别。
   2、免疫分子中目前研究的热点为细胞因子，它在免疫排斥调节中发挥着及其重要的作用。   细胞因子是指由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的小分子量多肽介质，通过与高亲和力特异性受体相互作用，在极低浓度下调控特异性免疫应答，包括免疫排斥中发挥极其重要作用，为其在临床的应用提供了基础。
   3、移植抗原根据组织相容性分为主要和次要两类，其中重要的为引起强烈排斥反应的主要组织相容性抗原（MHC）。  主要组织相容性抗原分为MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类抗原，它们为结构类似的细胞表面糖蛋白，主要的功能是向T细胞呈递抗原，在移植免疫排斥反应中发挥着极其重要作用。
   为了减轻器官移植的排斥反应，基于上述免疫原理，大量动物实验研究及临床实验应用免疫抑制药物，抑制淋巴细胞细胞的活化，减少相应细胞因子的分泌，抑制抗原的加工及提呈等多种途径，从而大大延迟了移植物的排斥时间，但是长期应用免疫抑制剂，抑制全身免疫功能增加了全身感染的危险性及恶性肿瘤的发生。
     为此人们为了避免长期服用免疫抑制剂，又能使移植物长期存活，尝试寻找新的办法。在1945年OWEN报道了两只遗传基因不同的异卵双生的牛血液中彼此存在有对方血液中存在对方的异型血细胞，从而揭示了生物体存在免疫耐受从而使研究进入新的时期。
   免疫耐受是指免疫系统接触抗原后形成的特异性无应答或低应答状态状态，这与使用免疫抑制剂或遗传缺陷造成的免疫抑制或无反应是不同的。  免疫耐受分类中与器官移植排斥关系最密切的是外周的成年期T细胞耐受，只有外周T细胞处于功能失活及无能状态，才能产生外周耐受，才能解决器官移植长期存活的问题。
  [11] 二、皮肤移植免疫基础及脱细胞真皮基质的应用 皮肤是覆盖在人体表面的人体最大的器官，占身体重量的14％～17％，它具有保护体内组织体内组织，排泄废物，调节体温感受冷热痛触等刺激，但是它的储备代偿再生能力有限。
    同时现代研究成果表明，皮肤是一个具有独特免疫功能的器官。[1] 皮肤由表皮和真皮组成，表皮为上皮组织，真皮为不规则的致密结缔组织。 表皮由角化的复层鳞状上皮组成，分为角质层、透明层、颗粒层和生发层四层，其中生发层和角质层是表皮基本结构。
  除复层鳞状上皮（角质形成细胞）外表皮还有一类非角质形成细胞，它散在于角质形成细胞之间，如郎格罕斯细胞和黑色素细胞。   真皮位于表皮深层，分为乳头层和网织层。乳头层内胶原纤维排列不规则，弹性纤维和网状纤维含量较少，各类结缔组织细胞较多，常见有成纤维细胞，肥大细胞、组织细胞和淋巴细胞等。
  网织层有粗大的胶原纤维组成，胶原纤维之间有较多的弹性纤维，即起到真皮支架的作用。 皮肤基本结构中表皮和真皮结构中含有上述细胞成分与免疫密切相关，这些细胞表面表达高密度的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子，它们是皮肤的APC，在皮肤移植排斥中发挥着重要的作用，这其中最重要的细胞为郎格罕斯细胞和角质细胞。
    实验表明，注射郎格罕斯细胞可明显加速皮肤移植物排斥和异体角质细胞注入真皮内可见明显的排斥反应[1] 由于皮肤功能及再生能力有限，在大面积烧伤患者应用全层的猪皮或者尸体的全厚皮肤覆盖创面起到安全过渡休克期和急性感染期，但是由于移植皮肤内的细胞引起排斥反应，异体皮肤不能长期存活[17，18]。
    所以设想从异种或异体真皮内除去诱导免疫排异的上皮细胞和内皮细胞成分,得到保持真皮原有结构、以真皮胶原为主体的低抗原性真皮替代物(DS) ,可减少或消除异种和异体真皮移植后的排异反应，达到上文所述的免疫耐受，以期移植物长期存活。
   这一设想首先由Wainwright[3]， Livesey[12]在异体无细胞真皮基质，动物实验和临床应用方面得到证实，作为网状自体刃厚皮片载体，获得较高的成活率，在短期覆盖创面方面起到很好的作用。
    国内烧伤界同行陈璧[2]，孙永华[4]应用异体无细胞真皮基质结合超薄皮片在大面积烧伤患者，同样取得较高的生存率和比较满意的功能。 虽然异体无细胞真皮基质移植取得较好的临床应用效果，但由于异体皮肤来源少，近年来,为进一步拓宽真皮替代物来源、摆脱异体皮肤存在的不足因素,人们再一次把目光转向无细胞异种真皮基质的研究应用。
    [13]由于动物实验存在严重的炎症反应导致创面愈合不良，国外对xeno-ADM仍持有审慎的态度[7，14]，但国内已过渡到临床应用上。通过反复冻融法[15]，渗透溶液法[16]，酶消化法和化学去污剂法[3]等脱细胞法脱去异种真皮组织内含有大量抗原性较强的细胞成分,包括附件上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞、郎格尔汉斯细胞和成纤维细胞等。
    经脱细胞后，真皮剩余的大部分为低抗原性非细胞成分，主要包括基质蛋白和胶原，但是仍会残留的免疫原性较强细胞膜抗原和基质蛋白，从而引起较强的免疫排斥反应。 冯祥生[5] ，姜笃生[6]等在临床应用xeno-ADM取得相关数据及经验。
  但是其在动物实验和临床应用后的免疫排斥及耐受机制研究仍较少，有待于进一步深入研究，从而通过对机制的某一方面进一步提高皮肤移植物的生存时间及达到移植成活后的满意功能。   三、皮肤移植后免疫排斥及耐受研究进展 在临床上诊断移植排斥方法包括检查移植物组织的病理改变和检测脏器功能改变，但是诊断上较晚，而细胞因子常在排斥反应的早期即被释放，可作为早期诊断指标。
  因此，研究人员做了许多细胞因子在器官移植后免疫排斥及耐受中作用的研究发现，确实细胞因子的表达变化与排斥和耐受具有密切的关系。   在Mosmann和Maggie发现CD4 T细胞分为Th1和Th2细胞，Th1细胞主要分泌IL-2，IFN-γ，TNF，GM-CSF等，TH2主要分泌IL-4，IL-5，IL-6，IL-10 ，IL-13等。
  进一步的研究表明Th1 型CK可抑制Th2 型CK的表达, Th2 型CK可抑制Th1 型CK的表达。  而且, 在排斥反应发生过程中常伴有Th1 型细胞因子( IL-2 、IFN-γ) 的表达增高和Th2 型细胞因子( IL-4 、IL-10) 的不表达或低表达, 而在免疫耐受时,则呈相反的情况。
  因而人们推测, 这种Th1 和Th2 型细胞因子相对水平的变化可能是产生排斥反应或者免疫耐受的重要原因。   国内外研究人员对皮肤移植后的免疫机理最先开始在动物身上进行，尤其对移植后细胞因子及免疫细胞分型的研究是个热点。
   国外学者Carquist JF等发现将A/J小鼠皮片移植给BALB/C小鼠后，无排斥反应时，IL-4水平较高，IFN-γ低下，而发生排斥时，出现相反的分泌模式，抗IL-4抗体的应用可打破已诱导的免疫耐受。
     Kirkiles Smith NC将猪皮移植给小鼠的研究发现：为了减少异体移植物排斥反应，阻断TNF信号因子和TNF应答基因产物是合适的治疗手段。 Hufnagel等曾在大鼠身上做混合淋巴细胞反应（MLR）从细胞水平推断混合皮片长期存活是由于所谓的“自体皮岛效应”产生的某种保护性因素。
    　 国内郑泽铎等在大鼠Ⅲ度烧伤行同种异基因混合皮肤移植，通过混合淋巴细胞反应（MLR）和检测外周血淋巴细胞亚群得出结果，混合移植皮组总反应强度各时相点均低于大张异体皮移植，从而证明混合皮肤移植在一定程度降低了机体免疫反应程度。
   吴建和等通过对Ⅲ度烫伤大鼠经切痂后分别采用单植自体皮、单植异体皮与混合植皮3组方案，在植皮后检测皮瓣浸液中的IL-1，IL-6和TNF的生物活性，结果IL-1、TNF在混合移植方案中处于低水平，IL-6则存在较高水平，从而得出结论高密度得IL-6可能通过一定机制降低局部IL-1、TNF的活性减缓局部免疫排斥反应，并且导致局部免疫耐受。
    青春等在自异体皮混合移植成活机制研究中发现IL-10在混合移植皮区在术后7、14天为自体皮区的3倍，而此时正是异体皮发生免疫排斥的关键时刻，因此得出结论局部的高IL-10水平可能在一定程度延缓异体皮的排斥反应。
  吴秋和在大鼠应用异种脱细胞真皮基质后测得IL-4和IL-10高表达。   以上在动物移植皮肤后细胞因子的变化规律与无论是动物实验还是人体器官移植，在排斥发生时，常能检测IL-2 ，IFN-γ基因的表达增高，而IL-4 ，IL-10的基因表达并不是总能检测到的观点有很高的一致性（）。
  这在其他的器官移植研究中得到证实，如Fandrich在诱导免疫耐受的研究中发现大鼠移植的心脏和全厚皮肤移植获得长期存活，在对移植心脏细胞因子的检测发现IL-4 ，IL-10明显上调。  Yamaguchi在大鼠肝脏移植存活时间明显延长的研究中发现移植物中IL-10大量分泌，同时IL-2 ，IFN-γ的分泌明显减少。
  BOB等在大鼠肾移植后细胞因子的表达与排斥的研究中发现，在组织学检查正常的肾脏中通过半定量PCR测定IL-4 ，IL-10的水平升高，而组织学排斥的肾脏IFN-γ转录增加。   皮肤移植在临床的上应用后的细胞因子的研究目前还是较少，具体的细胞因子在患者皮肤移植中的作用与动物实验和其他器官移植结果是否一致还有待进一步做临床研究。
  目前国内姜笃银陈璧等在这方面做了一定的研究，他们在大面积烧伤患者切痂创面上应用异种/异体脱细胞真皮基质移植，检测移植物，血清和创面渗液中的细胞因子，实验结果表明异种脱细胞真皮基质在排斥后IL-4低于排斥前，而IFN-γ则高于排斥后。
    还检测免疫细胞分型显示排斥后细胞分型以CD4 T细胞为主。研究结果看皮肤移植后细胞因子在人体上的变化基本上与动物实验保持基本一致。 因此，还需要在临床应用异体/异种皮后细胞因子与最终皮肤转归关系做进一步研究，从而使免疫的一方面指导异种及异体皮在临床上的应用。
  很高兴为您服务，希望我的回答对您有所帮助，谢谢您的支持和鼓励。  。[收起]