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如何在线设计qPCR引物
一笑而过 2019-10-14
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我心寂寞 2022-01-19
设计引物原则(1)引物最好在模板cDNA的保守区内设计;(2)引物长度一般在15~30碱基之间,过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应;(3)引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度,一般计算公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值;(4)引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性;(5)引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了;(6)引物扩增长度:一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp,常规PCR扩增长度建议200-500bp。一般PCR产物达到2-3k长度也是可以的,但要考虑到可能引入突变,因此建议使用高保真的聚合酶。
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