蒽酮比色定糖法用来测定可溶性多糖的方法
实验二 蒽酮比色法测糖
[日期:2005-3-20] 来源: 作者:lt [字体:大 中 小]
一 目的 掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法
二 原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的已糖或多糖中的已糖基、戊糖基及已糖醛酸起反应,反应后溶液呈蓝绿色,在620nm处有最大吸收。
本法多用于测定糖原的含量,也可用于测定葡萄糖的含量。
三 实验器材及试剂
马铃薯干粉
可调试移液器或移液管
可见分光光度计(723型)
电子分析天平
水浴锅
电炉子
蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中,以80%H2SO4定容到1000ml,当日配制使用。
标准葡萄糖溶液(0.1mg/ml):100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中,定容到1000ml备用。
四、操作
1.制作标准曲线
取7支干燥洁净的试管,按表1顺序加入试剂,进行测定。以吸光度值为纵坐标,各标准溶液浓度(mg/ml)为横坐标作图得标准曲线。
表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作
单位:ml
管号
0
1
2
3
4
5
6
标准葡萄糖溶液
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.6
0.8
蒸馏水
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.4
0.2
置冰水浴中5min
蒽酮试剂
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
沸水浴中准确煮沸10min,取出用流水冷却,室温放10min,于620nm处比色
葡萄糖浓度(mg/ml)
A620nm
2.样品含量的测定
样品液的制作:
精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min(不时摇动)—→取出,3000rpm离心10min(或过滤)—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml,再定容到10ml的容量瓶中
样品液的测定:
(1)取4支试管,按照表2加样(加蒽酮时需要冰水浴5min冷却)
表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定
单位:ml
试管号
1
2
3
4
样液
0
1.0
1.0
1.0
蒸馏水
1.0
0
0
0
蒽酮
4.0
4.0
4.0
4.0
A620nm
(2)加样冷却完成后置沸水中煮沸10min,取出流水冷却放置10min,620nm处比色测量各管OD值。
(3)以1号试管作为调零管,2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。
3.结果计算:
C×V
w = ————×100%
m,
式中w:糖的质量分数(%)
C:从标准曲线中查出的糖质量分数(mg/ml)
V:样品稀释后的体积(ml)
m:样品的质量(ml)