聚丙烯酰胺凝胶电泳中电极安装为什
编辑本段实验目的 测定蛋白质亚基的分子量及纯度
编辑本段实验原理 在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。 当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。
编辑本段基本过程 制胶、电泳、检测
试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1。 5mol/L Tris-HCl, pH8。8、1。0mol/L Tris-HCl, pH6。8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xlo...全部
编辑本段实验目的 测定蛋白质亚基的分子量及纯度
编辑本段实验原理 在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。
编辑本段基本过程 制胶、电泳、检测
试剂：（储液由专业人员配置）30%丙烯酰胺单体储液、10%过硫酸铵、TEMED、1。
5mol/L Tris-HCl, pH8。8、1。0mol/L Tris-HCl, pH6。8、10%SDS、10XTris-甘氨酸系统的电泳缓冲液、2Xloading buffer、水饱和正丁醇
器材：灌胶支架、玻璃板、梳子、电源、加热器、电泳槽、扫描仪
编辑本段实验操作程序 1．安装灌胶模具，依照说明书进行
2．按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过硫酸铵和TEMED在用前加入。
3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1。5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和正丁醇（或水饱和的异丙醇、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。
4．室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。
5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。
6．制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug）
7．加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。
8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴酚蓝前沿到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶，
9．溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。
10．染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。
11．扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。
编辑本段注意事项 1．在加过硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽气，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。
2．过硫酸铵和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。
3．分离胶聚合后最好在4℃放置12小时后再使用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。
4．为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。
5．如果带着梳子过夜可能会影响分辨率，所以浓缩胶最好在使用前再灌制。
6．如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近的带扩展。
7．对样品浓度不确定的情况下，加样时使用梯度加样法，能大致估计出样品的浓度。
常见问题及分析 1。
配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6。7，分离胶pH8。9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。
当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
2。 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。
一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。
100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。
3。 SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6。
7，分离胶选择pH8。9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
4。 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。
一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。
5。“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6。 “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。
处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7。 为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
8。 为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 9。 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。
但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
10。 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。
11。 为什么电泳的条带很粗？ 电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6。7）；适当降低电压； 12。 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 这种现象一般初学者易出现。
比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a。内外槽装反；b。外槽液过少；c。电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 处理办法：电泳槽正确装配即可。
13。 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。
14。 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。
如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 15。 电泳时间比正常要长？ 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。
收起
