杂交瘤技术的基本原理是什么?
(一)细胞的选择与融合
建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体,所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞,通常来源于免疫动物的碑细胞。脾是B细胞聚集的重要场所,无论以何种免疫方式刺激,脾内皆会出现明显的抗体应答反应。 融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖,只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤,所以是理想的脾细胞融合伴侣。目前常用的B细胞瘤株有:P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein,1975),P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein,1976),X63-Ag8...全部
(一)细胞的选择与融合
建立杂交瘤技术的是制备对抗原特异的单克隆抗体,所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞,通常来源于免疫动物的碑细胞。脾是B细胞聚集的重要场所,无论以何种免疫方式刺激,脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖,只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤,所以是理想的脾细胞融合伴侣。目前常用的B细胞瘤株有:P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein,1975),P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein,1976),X63-Ag8。
563(Kearneyetal,1979),Sp2/0-Ag14(Schulmanetal,1978)等,这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤,使细胞易于相互粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇(PEG1000~2000)是目前最常用的细胞融合剂,一般应用浓度为40%(W/V)。
(二)选择培养基的应用
细胞融合是一个随机的物理过程。
在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬中,经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。
正常的脾细胞在培养基中存活仅5~7天,无需特别筛选,细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。
细胞DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成DNA,叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。
另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下,经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分:次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T),所以取三者的字头称为HAT培养基。
氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂,可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA,而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株,所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能,可在HAT培养基中长期存活与繁殖(图11-1)。
图11-1细胞融合与HAT选择示意图
(三)有限稀释与抗原特异性选择
在动物免疫中,应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇,一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答,实质是众多B细胞群的抗体分泌。
而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程,在已经融合的细胞中,有相当比例的无关细胞的融合体,需细筛选去除。收起