动物繁殖的问题!
一,>2003年04期
车丽娟 , 荣立南
动物繁殖技术是生物技术的重要分支。传统的生物技术革新换代是从20世纪70年代初期开始的。分子生物学的某些突破使人们能够分离基因,并在体外进行重组。 这些突破迎来了生物技术的时代。作为繁殖技术从20世纪50年代人工授精技术到70年代胚胎移植技术的应用,似乎才真正开始动物繁殖技术的新纪元。本文在这里集中阐述了人工授精技术(AI),发情控制,体外受精,性别控制,胚胎低温保存,元性繁殖(克隆),胚胎分割和融合技术7个方面的动物繁殖技术的进展。
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二,生殖生理 繁殖技术
体外受精(In Vitro Fertilization)是指哺乳动物...全部
一,>2003年04期
车丽娟 , 荣立南
动物繁殖技术是生物技术的重要分支。传统的生物技术革新换代是从20世纪70年代初期开始的。分子生物学的某些突破使人们能够分离基因,并在体外进行重组。
这些突破迎来了生物技术的时代。作为繁殖技术从20世纪50年代人工授精技术到70年代胚胎移植技术的应用,似乎才真正开始动物繁殖技术的新纪元。本文在这里集中阐述了人工授精技术(AI),发情控制,体外受精,性别控制,胚胎低温保存,元性繁殖(克隆),胚胎分割和融合技术7个方面的动物繁殖技术的进展。
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二,生殖生理 繁殖技术
体外受精(In Vitro Fertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。
由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tube animal)。这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。
体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料，体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值。
在人类，IVF-ET技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少的组成部分。
一、体外受精技术的发展简史
早在1878年，德国人Scnenk就以家兔和豚鼠为材料，开始探索哺乳动物的体外受精技术，但一直没有获得成功。
直到1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展。 1959年，张明觉以家兔为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，然后，正常卵裂的36枚胚胎被移植到6只受体的输卵管中，其中4只妊娠，并产下15只健康仔兔，这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立。
20世纪60年代初至20世纪80年代中期，人们以家兔、小鼠和大鼠等为实验材料，进行了大量基础研究，在精子获能机理和获能方法方面取得很大进展。精子由最初在同种或异种雌性生殖道孵育获能，发展到用子宫液、卵泡液、子宫内膜提取液或血清等在体外培养获能，最后用化学成分明确的溶液培养获能。
同时，通过射出精子和附睾精子获能效果的比较研究，人们发现射出精液中含有去能因子，并认识到获能的实质是去除精子表面的去能因子。这些理论和方法上的成就，推动了体外受精技术的发展，试管小鼠(Whit-tingham，1968)、大鼠(Toyoda和Chang，1974)、婴儿(Steptoe和Edwards，1978)、牛(Brackett等，1982)、山羊(Hamda，1985)、绵羊(Hanada，1985)和猪(Chang等，1986)等相继出生。
20世纪80年代中期以后，以牛为代表的家畜IVF技术发展迅速，1986年Parrish等用含肝素的介质处理牛的冷冻精液，然后与体外成熟的卵母细胞体外受精获得成功。这对牛IVF的研究和应用具有重要意义，因为这种方法可利用屠宰场废弃的卵巢和冷冻精液进行胚胎体外生产，不仅成本低廉，而且效果稳定。
此后，牛的卵母细胞体外成熟和胚胎培养体系逐步趋于成熟，胚胎体外生产效率得到很大提高。目前，采用IVF-ET技术，每对废弃的牛卵巢可获得3头左右的犊牛。为充分利用良种母牛的遗传资源，20世纪80年代后期，牛的活体取卵技术（Ovum pick UP。
OPU）发展迅速。活体取卵和IVF-ET结合已成为欧、美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群选择的重要繁殖技术。
牛的体外受精技术不仅应用于畜牧生产，同时，也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段。
二、体外受精技术的基本操作程序
哺乳动物体外受精的基本操作程序，主要环节包括以下几个方面:
(一)卵母细胞的采集和成熟培养
1．卵母细胞的采集：卵母细胞的采集方法通常有三种。
(1)超数排卵：雌性动物用促卵泡素和促黄体素处理后，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。
在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。这种方法的关键是掌握卵子进入输卵管和卵子在输卵管中维持受精能力的时间，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前冲取。
(2)从活体卵巢中采集卵母细胞 ：这种方法是借助超声波探测仪、内窥镜或腹腔镜直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。
在家畜中， 牛和马等大家畜常用超声波探测仪辅助取卵，其方法是用手从直肠把握卵巢，经阴道壁穿刺插入吸卵针，借助B型超声波图像引导，吸取大卵泡中的卵母细胞。按照目前的技术水平，一头健康母牛每周可获得5~10枚卵子。
在家畜中，活体采集的卵母细胞一般要经成熟培养后才能与精子受精。这种方法对扩繁优良母畜具有重大意义，在有些国家已用于商业化生产。
(3)从屠宰后母畜卵巢上采集卵母细胞：这种方法是从刚屠宰母畜体内摘出卵巢，经洗涤、保温（30℃~37℃)后，快速运到实验室，在无菌条件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直径卵泡中的卵母细胞（牛卵泡直径要求3-10mm）也可对卵巢进行切片，收集卵母细胞。
用此方法获得的卵母细胞多数处于生发泡期(GV期)，需要在体外培养成熟后才能与精子受精。从废弃卵巢中采集卵母细胞的关键是注意卵巢的保温和防止细菌污染。因此卵巢从畜体摘取后须放入含有生理盐水或磷酸缓冲液（PBS）的保温瓶中；吸卵前卵巢要用生理盐水或PBS多次洗涤；所用溶液都要添加抗生素。
这种方法的最大优点是材料来源丰富，成本低廉，但确定母畜的系谱困难。
2．母细胞的选择：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocyte complesx COC）。
无论采用何种方法，采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围。在家畜体外受精研究中，常把未成熟卵母细胞分为A、B、C和D四个等级。A级卵母细胞要求有三层以上卵丘细胞紧密包围，细胞质均匀；B级要求卵母细胞质均匀，卵丘细胞层低于三层或部分包围卵母细胞；C级为没有卵丘细胞包围的裸露卵母细胞；D级是死亡或退化的卵母细胞。
在体外受精实践中，一般只培养A级和B级卵母细胞。
3．卵母细胞的成熟培养：由超数排卵采集的卵母细胞已在体内发育成熟，不需培养可直接与精子受精，对未成熟卵母细胞需要在体外培养成熟。培养时，先将采集的卵母细胞在实体显微镜经过挑选和洗涤后，然后放入成熟培养液中培养。
家畜卵母细胞的成熟培养液目前普遍采用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常采用微滴培养法，微滴体积为50-200微升，每滴中放入的卵母细胞数按每5微升一个计算单位。卵母细胞移入小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39℃、100%湿度和5%二氧化碳的空气。
牛的培养时间为20-24小时，卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后，卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，用DNA特意性染料染色后，在显微镜下进行核相观察，可见卵母细胞处于第2次成熟分裂中期。
(二)体外受精
1．精子的获能处理：哺乳动物精子的获能方法有培养和化学诱导两种方法。牛、羊的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的药物常用肝素和钙离子载体。
2．受精：即获能精子与成熟卵子的共培养，除钙离子载体诱导获能外，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。
受精培养时间与获能方法有关。在B2液中一般为6-8小时而用TALP或S。F液作受精液时可培养18~24h。精子和卵子常在小滴中共培养，受精时精子密度为1~9×10 6/ml，每10微升精液中放人1~2枚卵子，小滴体积一般为50~200微升。
(三)胚胎培养
精子和卵子受精后，受精卵需移入发育培养液中继续培养以检查受精状况和受精卵的发育潜力，质量较好的胚胎可移入受体母畜的生殖道内继续发育成熟或进行冷冻保存。
提高受精卵发育率的关键因素是选择理想的培养体系。
在家畜中，胚胎培养液分为复杂的和化学成分明确的培养液两大类。复杂培养液中的成分很多，除无机和有机盐外，还添加维生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等营养成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。
用它们培养胚胎时，可以采用体细胞共培养体系，即体细胞与胚胎在微滴中共同培养，利用体细胞生长过程中分泌的有益因子，促进胚胎发育，克服发育阻断。
受精卵的培养广泛采用微滴法，胚胎与培养液的比例为一枚胚胎用3~10微升培养液；一般5~10枚胚胎放在一个小滴中培养以利用胚胎在生长过程中分泌的活性因子，相互促进发育。
胚胎培养条件与卵母细胞成熟培养条件相同。有的实验室采用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合气体培养，以降低培养液中氧自由基浓度，提高胚胎发育率。胚胎在培养过程中要求每48-72小时更换一次培养液，同时观察胚胎的发育状况。
当胚胎发育到一定阶段时可进行胚胎移植或冷冻保存，牛、羊受精卵通常培养到致密桑椹胚或囊胚时进行移植或冷冻保存。
三、家畜体外受精技术的发展现状和存在的问题
(一)发展现状：家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进展，其中牛的IVF水平最高，入孵卵母细胞(即进入成熟培养)的卵裂率为80%~90%，受精后第七天的囊胚发育率为40%~50%，囊胚超低温冷冻后继续发育率为80%，移植后的产犊率为30%~40%。
平均每个卵巢可获得A级卵母细胞10个左右，经体外受精可获得3~4个囊胚，移植后产犊1~2头。
(二)存在的问题和发展方向
1．存在的问题
(1)囊胚发育率低，细胞数少。体外受精卵在培养过程中普遍存在发育阻断(developmental
block)，即胚胎发育到一定阶段后停止发育并发生退化的现象。
牛胚胎阻断发生在8~16细胞阶段，这就导致体外受精卵的囊胚发育率远低于体内受精。此外，与体内受精囊胚相比，体外受精囊胚的细胞总数和内细胞团细胞数明显减少。
(2)产犊率低，胎儿初生重高。家畜体外受精胚胎，特别是牛的IVF胚胎移人受体后，产犊率比体内受精低15%~20%，但胎儿初生重比人工授精后代高3~4kg，导致受体母畜难产率高。
2．发展方向
(1)深入研究卵母细胞成熟和胚胎发青的分子机理 体外受精效率低的主要原因是人
们对卵子发生和胚胎发育的分子机理了解不够。大幅度提高IVF效率的前提是探明卵母细胞和早期胚胎发育的分子调控机理，然后以此理论为指导，研究理想的培养体系，促使胚胎基因组得到稳定、有序表达。
(2)加强腔前卵泡培养的研究，利用优良母畜的遗传资源 目前IVF技术利用的卵母细胞不足家畜卵巢上卵母细胞总数的千分之一。为此，一方面提高活体取卵技术，另一方面需研究腔前卵泡和小卵泡的体外成熟技术。
为保证卵母细胞的稳定来源及良种母畜或濒危动物的保种，卵泡和卵母细胞的超低温冷冻保存技术的研究也必须加强。
(3)加强体外受精与其他生物技术的结合。体外受精与转基因、克隆、性别控制及胚胎干细胞的培养密不可分。
通过体外受精可为外源基因的导人提供充足的胚胎来源；为克隆技术提供成熟卵母细胞和克隆胚胎的培养体系；用分离的X和Y精子与卵子体外受精，可对哺乳动物进行性别控制。同样，胚胎干细胞的分离也需要IVF技术提供胚胎和培养体系。
这些生物技术的综合发展将对人类生活产生重大影响。
四、辅助受精技术
辅助受精技术(Techniques f。r assisted fertilizati。n)是IVF的延伸，它是通过人为方法使精子和卵子完成受精过程，克服在某些情况下精子不能穿过透明带和卵黄膜的缺陷。
这项技术起源于20世纪60年代，20世纪80年代得到迅速发展，在医学上已成为治疗某些男性不育症的主要措施之一；在基础生物学中，它对研究哺乳动物受精和发育机理有很重要的价值；它还对挽救濒危动物和充分利用优良种公畜等有重要意义。
目前哺乳动物的辅助受精技术有透明带修饰和精子注人两种方法。由于两种方法都需要借助显微操作仪来完成，所以又称辅助受精技术为显微授精(microinsemination)。
(一)透明带修饰法：它是运用物理或化学方法对卵母细胞的透明带进行打孔、部分切除或撕开缺口，为精子进入卵黄周隙打开通道，然后把卵子与一定浓度的精子共培养以完成受精过程。
这种方法适用于具有一定运动能力，但顶体反应不全，无法穿过透明带的精子。它的优点是对卵子的损伤小，但对于靠透明带反应阻止多精入卵的动物易造成多精子受精，影响胚胎继续发育。目前这种方法仅在小鼠中取得成功。
(二)精子注入法：它是利用显微操作仪直接把精子注入卵黄周隙或卵母细胞的胞质中，前者称透明带下授精(subzonal inseminatiom SUZI)，后者称胞质内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)。
透明带下授精对注入的精子数有严格要求：具有活力且已发生顶体反应的精子要单个注入；没有发生顶体反应的精子，注入的数目可加大。SUZI的优点是对卵母细胞的损伤小，已在临床医学上得到运用，但多精入卵是制约这一技术发展的主要原因。
胞质内精子注射对精子活力、形态和顶体反应没有特殊要求，只需注入单个精子即可，为提高受精率，注射后卵子需要人为激活。胞质内注射精子作为治疗男性受精障碍症的方法已在许多国家得以应用，由此获得的试管婴儿数已超过3000例。
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